第59卷 第3期2023年06月
青岛大学学报(医学版)
J O U R N A LO FQ I N G D A O U N I V E R S I T Y (M E D I C A LS C I E N C E S
)V o l .59,N o .3J u n e  2023
[收稿日期]2022-09-01; [修订日期]2023-05-23
[基金项目]国家自然科学基金面上项目(32171131)[第一作者]韩帆(1997-)，女，硕士研究生㊂[通信作者]陈曦(1980-)，女，博士，副教授，硕士生导师㊂E -m a i l :c a s e y
1201@163.c o m ㊂不同月龄A 53T 小鼠背根神经节中α-S y
n 表达变化韩帆，焦倩，杜希恂，阎春玲，姜宏，陈曦
(青岛大学国家生理学重点(培育)学科，山东青岛 266071
)[摘要] 目的 探讨不同月龄A 53T 转基因(A 53T )小鼠脊髓背根神经节(D R G )中α-突触核蛋白(α-S y
n )表达水平的变化㊂方法 6月龄和12月龄野生型(WT )小鼠和A 53T 小鼠经乌拉坦腹腔麻醉后处死，在体视显微镜下取出胸段㊁腰段和荐段的D R G 组织，采用蛋白免疫印迹法检测D R G 中α-S y n 的表达水平㊂结果 与相同月龄WT 小鼠相比,6月龄及12月龄A 53T 小鼠D R G 中α-S y
n 表达量显著增加(F =59.164㊁55.681,P <0.01)；与6月龄A 53T 小鼠相比,12月龄A 53T 小鼠D R G 中α-S y
n 的表达量显著增加(F =13.802,P <0.05)㊂结论 A 53T 小鼠D R G 中α-S y
n 表达量高于同月龄WT 小鼠，且其表达量随年龄增长而增加㊂[关键词] α突触核蛋白;
帕金森病；小鼠，转基因；神经节，脊[中图分类号] R 338.2  [文献标志码] A  [文章编号] 2096-5532(2023)03-0337-04
d o i :10.11712/j
m s .2096-5532.2023.59.075[开放科学(资源服务)标识码(O S I D )
][网络出版] h t t p
s ://k n s .c n k i .n e t /k c m s 2/d e t a i l /37.1517.R.20230719.1618.003.h t m l ;2023-07-20 14:53:22E X P R E S S I O NO Fα-S Y N U C L E I NI N T H E D O R S A L R O O T G A N G L I O N O FA 53T M I C E W I T H D I F F E R E N T A G E SI N M O N T H S HA N F a n ,J I A OQ i a n ,D UX i x u n ,Y A NC h u n l i n g ,J I A N G H o n g ,
C H E N X i  (S t a t eK e y
D i s c i p l i n e :P h y s i o l o g y (i n I n c u b a -t i o n ),D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g y ,Q i n g d a oU n i v e r s i t y ,Q i n g
d a o 266071,C h i n a )[A B S T R A C T ] O b j
e c t i v e  T o i n v e s t i g a t e t h ee x p r e s s i o n l e v e l o
f α-s y n u c l e i n (α-S y n )i nt h ed o r s a l r o o t
g a n g l i o n (D R G )o f A 53Tt r a n s g e n i cm i c ew i t hd i f f e r e n t a g e s i nm o n t
h s . M e t h o d s  W
i l d -t y p e (WT )m i c ea n dA 53T m i c e ,a g
e d6o r 12m o n t h s ,w e r e s a c r i
f i c e da f t e r i n t r a p e r i t o n e a l a n e s t h e s i aw i t hu r e t h a n e .D R Gt i s s u es a m p l e so f t h e t h o r a c i c ,l u m b a r ,a n ds a c r a l s e
g m e n t s w e r e c o l l e c t e d u n d e r a s t e r e o m i c r o s c o p e ,a n dW e s t e r n b l o t t i n g w a s u s e d t om e a s u r e t
h e e x p r e s s
i o n l e v e l o f α-S y
n . R e s u l t s  C o m -p a r e dw i t h t h eWT m i c ew i t h t h e s a m e a g e i nm o n t h s ,t h eA 53T m i c e a g e d 6o r 12m o n t h s h a d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e e x p r e s -s i o n l e v e l o f α-S y n i nD R G (F =59.164,55.681;P <0.01).C o m p a r e dw i t h t h eA 53T m i c e a g e d 6m o n t h s ,t h eA 53T m i c e a g
e d 12m o n t h sh a d a s i g n i
f i c a n t i n c r e a s e i n t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f α-S y n i nD R G (F =13.802,P <0.05). C o n c l u s i o n  A 53T m i c e h a v e a h i
g
h e r e x p r e s s
i o n l e v e l o f α-S y n i nD R Gt h a n WT m i c ew i t h t h e s a m ea g e i n m o n t h s ,a n d t h ee x p r e s s i o n l e v e l o f α-S y n i n c r e a s e s w i t ha g
e .[K E Y W O R D S ] a l p h a -s y n u c l e i n ;P a r k i n s o nd i s e a s e ;m i c e ,t r a n s g e n i c ;g a n g l i a ,s p
i n a l  帕金森病(P D )是一种主要影响运动功能的神经退行性疾病，其发病率随着年龄增加而逐渐上
升[1-3]
㊂目前,P D 发生的确切原因和机制仍不完全
清楚，但大量研究表明，基因突变是重要的因素之一[4-7]
㊂A 53T 转基因(A 53T )
小鼠是一种常见的P D 模型小鼠，其体内携带的人类A 53T 突变型α-突触核蛋白(α-S y n )基因可改变α-S y n 的结构，使原本可溶性的α-S y n 单体转变为不溶性的多聚体，可在动物体内重现由α-S y
n 聚集起始的P D 病理过程[8-12]
㊂根据B R A A K 学说可知，胃肠道可能是α-S y n 发生病变的起始部位[13-16
]，且这些病理性α-S y
n 会通过外周神经系统逐渐向中枢传播[
17
]㊂已有大量实验证实迷走神经在α-S y n 的肠-脑传播中承担主要作用，但是消化道与中枢之间还存在其他神经联络，如交感神经，其传入纤维的胞体主要汇聚在脊髓背根神经节(D R G )中㊂为明确D R G 中是否也存在着α-S y
n 高表达，本实验观察了不同月龄A 53T 小鼠D R G 中α-S y n 的含量变化，从而为交感神经传入纤维参与α-S y n 从胃肠道传播至中枢的可能作用提供证据㊂现将结果报告如下㊂1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 A 53T 小鼠(品系名称:B 6;C 3-T g (P r n p
-S N C A *A 53T )83V l e /J ),S P F 级，购于南京大学模式动物研究所㊂小鼠饲养于清洁级动物房中，可自由进食饮水，饲养环境为光照模拟自然昼夜节律,12h 明暗交替，温度保持在20~24ħ,
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338青岛大学学报(医学版)59卷
对湿度保持在40%~60%㊂选用6月龄和12月龄的纯合子A53T小鼠作为实验组，同窝相同月龄的野生型(WT)小鼠作为对照组㊂
1.1.2试剂α-S y n抗体㊁β-t u b u l i n抗体购于美国
C e l l S i g n a l i n g T e c h n o l o g y公司；山羊抗兔和山羊抗鼠抗体购于英国T h e r m oF i s h e rS c i e n t i f i c公司;
0.45μm P V D F转印膜㊁E C L化学发光液均购于美国M i l l i p o r e公司:R I P A裂解液购于中国C o m W i n B i o t e c h公司㊂A53T小鼠基因型鉴定P C R试剂盒购于中国V a z y m e生物科技有限公司㊂
1.2实验方法
1.2.1 A53T小鼠基因鉴定 A53T纯合子小鼠由A53T杂合子小鼠配种育得，饲养至1月龄进行分笼和鉴定㊂于尾尖部截取0.5c m长鼠尾组织提取D N A，按照试剂盒(T a q P r o H S U+P r o b e M a s t e r M i x,V a z y m e生物科技有限公司)说明配制实时荧光定量P C R反应体系并进行实验㊂根据P C R数据计算әC t值，通过比较实验组与对照组纯合子目的基因的әC t值，确定基因型㊂
1.2.2蛋白免疫印迹法检测D R G中α-S y n表达小鼠经乌拉坦腹腔麻醉处死后取出脊柱，于体视显微镜下取出胸段㊁腰段和荐段的D R G组织放入E P 管中，先用剪刀将组织剪碎，再加入配制好的R I P A 裂解液，充分磨碎组织㊂冰上静置裂解30m i n后，应用高速离心机在4ħ下以12000r/m i n离心20m i n，吸取上清液转移至新的1.5m L E P管中，利用B C A试剂盒和酶标仪进行蛋白质定量，计算上样量
㊂按比例加入l o a d i n g b u f f e r，充分混匀,100ħ煮沸10m i n使蛋白充分变性,-20ħ冻存㊂蛋白样品经S D S-P A G E电泳(90V㊁30m i n,120V㊁60m i n)分离后，湿法转至孔径为0.45μm的P V D F 膜上，按蛋白M a r k e r将目标蛋白裁剪出来，经脱脂奶粉封闭㊁一抗孵育㊁H R P-I g G二抗孵育后，用T B S T缓冲液洗净，将膜与E C L超敏发光液反应后置于凝胶成像系统内进行观察并拍摄图像㊂采用I m a g e J分析软件对蛋白条带进行灰度计算，目的蛋白表达水平以α-S y n和β-t u b u l i n g条带灰度值的比值表示㊂
1.3统计学处理
应用S P S S25.0软件进行统计学处理㊂小鼠D R G中α-S y n的表达量以 xʃs表示，不同月龄WT和A53T小鼠D R G中α-S y n表达水平比较采用析因设计的方差分析,P<0.05表示差异具有统计学意义㊂
2结果
2.1 A53T小鼠鉴定
P C R结果显示，对照组和实验组纯合子目的基因әC t平均值分别为5.84ʃ0.57和6.11ʃ0.47㊂әC t值大于对照组纯合子目的基因әC t值的小鼠为A53T纯合子小鼠㊂共选取10只A53T纯合子小鼠进行实验㊂
2.2不同月龄WT和A53T小鼠D R G中α-S y n表达比较丰田ft-hs
蛋白免疫印迹法检测结果显示,6月龄WT组(n=6)㊁6月龄A53T组(n=6)㊁12月龄WT组(n=4)和12月龄A53T组(n=4)小鼠D R G中α-S y n表达水平分别为0.18ʃ0.07㊁1.09ʃ0.21㊁0.46ʃ0.22和1.63ʃ0.35㊂析因设计方差分析结果显示: F月龄=17.417,P<0.01;F组别=112.168,P<0.01; F月龄ˑ组别=1.727,P>0.05㊂与同月龄WT组小鼠相比,6月龄㊁12月龄A53T组小鼠D R G中α-S y n 表达量显著增高，分别增加了505.56%和254.35%，差异均具有统计学意义(F=59.164㊁55.681,P< 0.01);12月龄A53T组小鼠D R G中α-S y n表达量比6月龄A53T组小鼠增加了50.46%，两组相比差异具有统计学意义(F=13.802,P<0.05)㊂表明A53T小鼠D R G中α-S y n的表达远高于同月龄WT小鼠，且随年龄的增长，其表达量增加㊂
3讨论
大量临床数据表明，在典型的P D运动症状出现之前，胃肠道功能障碍就已经在P D病人身上长期存在，包括便秘㊁胃轻瘫等[18-24]㊂德国的B R A A K 教授于2003年提出了经典的P D分期学说，该学说指出胃肠道是病理性α-S y n蛋白传播的起源地，并且通过肠脑轴逐渐蔓延至中枢神经系统[25-26]㊂其中,α-S y n通过迷走神经传播进入迷走神经运动背核(D MV)是肠脑轴传播的重要组成部分㊂后续有实验表明，迷走神经切断术可以使P D的发展进程大幅减缓，并且使P D的患病风险大大降低[27-30]㊂但该法仍不能完全杜绝P D，这提示α-S y n在胃肠与中枢之间传播可能还有其他的通道㊂支配消化道的神经除迷走神经外，还有交感神经，其传入纤维的胞体主要汇聚在脊髓D R G中，可感受消化道内机械
刺激(如管壁扩张㊁胃肠道蠕动等)㊁化学刺激(如管
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3期韩帆，等.不同月龄A53T小鼠背根神经节中α-S y n表达变化339
腔内毒性物质㊁酸碱度等)以及温度的变化等，并将
这些信息传入中枢神经系统㊂与迷走神经类似，交
感神经在消化道和中枢神经系统之间也起桥梁作
用，那么它是否在α-S y n的传播过程中起某些作用呢?本研究对此进行了探讨㊂
本实验选取小鼠胸椎㊁腰椎和荐椎处的D R G 组织进行检测，来自消化道的交感神经传入纤维主要通过以上部位进入脊髓，可充分反映交感神经传入纤维在病理性α-S y n肠脑传播中的作用㊂实验结果显示，与同月龄WT组小鼠相比,6月龄㊁12月龄A53T组小鼠D R G中α-S y n表达量显著增加，且随年龄的增长,A53T小鼠D R G中α-S y n表达量会进一步增加，表明交感神经中确实存在病理性α-S y n㊂值得注意的是，本实验所取组织来源于A53T小鼠，该小鼠是一种携带人类A53T突变型α-S y n基因的P D模型小鼠，其体内存在广泛的人A53T突变型α-S y n过表达㊂那么，本实验中小鼠D R G中α-S y n 增
多的原因，是否仅与该部位的基因突变相关呢?已有实验表明,3月龄A53T小鼠小肠组织中α-S y n 的表达已经明显升高，且出现了消化道功能障碍，但此时中枢神经系统内并未出现病理性的α-S y n，此种情况甚至会持续到6月龄以后，提示老龄A53T 小鼠中枢病理性α-S y n的增多可能亦与该蛋白从外周至中枢的传播有关[31-33]㊂故作者推测A53T小鼠D R G中α-S y n的增多也可能与交感神经在此传播过程中的作用相关㊂有其他研究也报道了交感神经的可能作用，如P D病人肾上腺中存在α-S y n的沉积，肾上腺髓质中包含由交感神经胞体组成的神经节，在这些神经节及发出的神经纤维中均观察到α-S y n聚集的现象[34-35]；在膀胱和生殖器官附近的交感神经神经节中同样出现了路易小体[24,36]㊂这些证据均表明交感神经可能参与了P D进展，并且可能与病理性α-S y n的传播有关㊂
综上所述,A53T小鼠D R G中α-S y n的表达量显著增加，且其表达量随年龄的增长同步上升，提示交感神经在P D进展中可能发挥作用㊂本实验结果可为P D发生机制研究提供实验依据，同时为通过阻断α-S y n由外周向中枢传播来P D提供了新的思路㊂
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(本文编辑马伟平)
医学学术论文引言的写作
引言是论文主体部分最前面的一段小短文，主要是起提纲挈领的作用，让读者了解本文研究的目的㊁范围和结果等信息，以引导读者阅读㊂引言的主要内容包括立题的缘由㊁背景和依据，研究方法和预期目的，以及本文创新价值和意义等㊂其叙述顺序如下㊂①缘由：提出一个问题
(想到或遇到的);②背景：交代有关研究的历史和现状;③方法：用什么方法进行研究;④目的：达到什么目的㊂要求重点突出，评价客观，少用套话，勿与摘要雷同，首尾呼应㊂篇幅一般以200~300字为宜，不宜把引言写成小综述㊂
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