杨 璇 刘小鹏 宋彬彬 武香梅 王浩然 胡月青 于 佳
【摘要】 目的 探讨帕金森病相关蛋白Lrrk2对内质网蛋白输出功能的调节作用及相关机制。方法 利用Lrrk2基因敲除小鼠（Lrrk2-/-小鼠）及野生型小鼠（Lrrk2+/+小鼠）获取成纤维细胞和皮质神经元，应用免疫荧光染法检测Lrrk2缺失对内质网出口位点（ERES）形态以及对N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）亚基NR2A 输出至胞膜的过程的影响。结果 Lrrk2缺失导致成纤维细胞中ERES 直径增大，与内质网至高尔基体蛋白运输抑制剂Brefeldin A（BFA）处理效果类似；Lrrk2缺失抑制了河豚毒素（TTX）所诱导的NR2A 蛋白输出至胞膜过程。结论 Lrrk2缺失导致内质网至高尔基体蛋白输出功能障碍，而这种异常会抑制神经元活性依赖的NMDA 受体蛋白输出至胞膜的过程。
【关键词】 帕金森病；富亮氨酸重复激酶2；内质网出口位点；Sec16A ；N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基NR2A
中图分类号：R742.5 文献标识码：A 文章编号：1006-351X（2019）10-0611-04
The study of mechanism of impaired endoplasmic reticulum export induced by Lrrk2 deficiency Yang X
uan, Liu Xiaopeng, Song Binbin, Wu Xiangmei, Wang Haoran, Hu Yueqing, Yu Jia. Institute of Geriatrics and Rehabilitation, the Beijing Geriatric Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100095, China Corresponding author: Liu Xiaopeng, Email: bghigr@163; Yu Jia, Email: jyu319@163
【Abstract 】 Objective To investigate the regulation of Lrrk2 on endoplasmic reticulum export and the related mechanism. Methods Immunostaining was applied on fibroblasts and cortical neurons derived from Lrrk2 knockout mice （Lrrk2-/-mice） and wild type mice （Lrrk2+/+ mice） to detect the effects of Lrrk2 deficiency on the morphology of endoplasmic reticulum exit sites （ERES） and the delivery of NMDAR （N-methyl-D-aspartic acid receptor） subunit NR2A to the cell membrane in . Results The knockout of Lrrk2 increased the diameter of ERES in fibroblasts, similar to the effect of BFA, an inhibitor of ER to Golgi export. Lrrk2 deletion inhibited the protein export of NR2A to cell membrane induced by TTX treatment. Conclusion Loss of Lrrk2 impaired ER to Golgi export，thereby inhibits the activity-dependent NMDA receptor protein export to cell membrane.
【Keyword 】 Parkinson’ s disease; Leucine-rich repeat kinase 2; Endoplasmic reticulum exit sites; Sec16A; N-methyl-D-aspartic acid receptor subunit NR2A
·论 著·
基金项目：北京市自然科学基金资助项目（7184221）；国家自然科学基金资助项目（81601117）；北京市百千万人才工程资助项目（2017A14）；北京市科技新星计划资助项目（Z181100006218045）；北京市医院管理局临床医学发展专项（“扬帆计划”，ZYLX201833）；北京老年医院院内课题（2017bjlnyy-青-2）
作者单位：100095北京，北京中医药大学附属北京老年医院老年病临床与康复研究所
通信作者：刘小鹏，Email ：bghigr@163 ；于佳，Email ：jyu319@163
帕金森病（Parkinson’ s disease, PD） 是一种由中脑多巴胺能神经元变性死亡引起进行性运动功能障碍的神经退行性疾病，可分为无明显诱因的散发性和与遗传因素有关的家族性病例。富亮氨酸重复激酶2（leucine-rich repeat kinase 2，Lrrk2）编码基因
小鹏LRRK2是家族性PD 最常见的致病因素，同时也是
散发性PD 的危险因子［1］。目前研究已发现Lrrk2参与神经轴突生长、线粒体功能异常细胞自噬和内体-溶酶体功能异常等多种病理过程［2-4］。神经元内质网蛋白质加工和输出异常是PD 发生的一个重要病理机制，本课题组前期研究发现Lrrk2和内质网出口位点（endoplasmic reticulum exit sites，ERES）支架蛋白Sec16A 存在相互作用，且Lrrk2表达缺失会导致细胞内Sec16A 异常分布。据此，本
实验利用免疫荧光染法以探讨Lrrk2对内质网蛋白输出功能的调节作用及相关机制，进一步阐明LRRK2生理和病理功能。
材料与方法
1. 实验动物
Lrrk2基因敲除小鼠（Lrrk2-/-小鼠）及其野生型（Lrrk2+/+小鼠）的同窝对照组［5］，饲养在北京中医药大学实验动物中心的屏障环境中，根据实验动物相关管理规定进行操作和处理。
2. 主要试剂
小鼠单克隆Sec31A抗体、小鼠单克隆N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）亚基NR2A抗体购自BD Transduction Laboratories公司，木瓜蛋白酶购自Worthington Biochemicals公司，BME培养基、葡萄糖储液、阿糖胞苷购自美国Sigma公司，B27添加剂、N2添加剂、Glutamax添加剂、胎牛血清购自美国Invitrogen公司，GFP-NR2A质粒购自美国Addgene 公司，Fugene HD转染试剂购自美国Roche公司。3. 小鼠原代成纤维细胞培养
小鼠原代成纤维细胞来源于出生后0d乳鼠的背皮。将背皮切成小块，加入含0.25%胰蛋白酶和0.01%脱氧核糖核酸酶I的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲DMEM培养基（dulbecco's modified eagle medium），3
7度孵育20 min。然后将组织转移到含10%胎牛血清的DMEM中，反复吹打，取细胞悬液，种植于24孔板中。在细胞内表达大T 抗原以建立永生化成纤维细胞系，本实验使用传代7代以下的细胞。
4. 小鼠原代皮质神经元培养
从出生24h内的乳鼠脑中分离出大脑皮质，剪碎，使用5 U.mL-1木瓜蛋白酶在37°C下消化40min。终止消化后，将脑组织吹打成单细胞悬液。以250 g离心5 min，随后用含有5%胎牛血清、1× B27添加剂、1×N2添加剂、1×Glutamax添加剂、0.45%葡萄糖、10 U.mL-1青霉素和10 µg.mL-1链霉素的BME培养基将沉淀的细胞再次悬起，将神经元接种于包被有右旋多聚赖氨酸的圆形玻片上（美国BD Bioscience公司），置于37°C、5% CO2培养箱中培养。24h后，更换为含有1 µM阿糖胞苷的无血清培养液，此后每2d半量换液。
5. 神经元转染GFP-NR2A质粒
利用Fugene HD转染试剂将GFP-NR2A质粒转
染进入小鼠原代皮质神经元。小鼠原代皮质神经元培养于24孔板中，对于每孔细胞，分别使用50µL OPTI-MEM I培养基稀释GFP-NR2A质粒和Fugene HD转染试剂。混合稀释后的GFP-NR2A质粒和Fugene HD转染试剂，在室温静置15min。缓慢向细胞中加入上述混合物，摇动培养板，轻轻混匀。
将细胞置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养； 6h 后将转染液更换为完全培养基。转染72h进行实验。6. 神经元细胞表面NR2A的染
在37°C条件下，将小鼠原代皮质神经元孵育于含有NR2A抗体的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）中10min，PBS清洗两遍后用4%多聚甲醛固定。用封闭液对荧光二抗进行稀释，室温下孵育细胞1h，PBS清洗5遍。封片晾干后，在激光共聚焦显微镜（LSM 510，Zeiss）下观察拍照。
7. 免疫荧光染
将培养在盖玻片上的细胞用PBS清洗两遍，然后用-20°C甲醇将细胞在冰上固定7min。用PBS每隔5min清洗细胞3次，用封闭液（含10%血清的PBS）孵育1h，然后室温下用一抗孵育3h，清洗3遍。用封闭液对荧光二抗进行稀释，室温下孵育细胞1h，PBS清洗5遍。封片晾干后，在激光共聚焦显微镜（LSM 510，Zeiss）下观察拍照。
8. 统计学方法
使用统计软件GraphPad Prism 5（美国GraphPad Software公司）进行分析。数据以 x±s表示，各组结果比较时采用单因素方差分析（ One-way ANOVA）或双因素方差分析（Two-way ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果
1. Lrrk2缺失导致ER蛋白输出障碍（图
1）
图1 Lrrk2基因敲除小鼠成纤维细胞中ERES 形态异常（a P ＜0.05，b P ＜0.01，n =10-15）
利用Sec31A 免疫荧光染标记Lrrk2+/+和Lrrk2-/-小鼠成纤维细胞中ERES，结果发现Lrrk2基因敲除小鼠成纤维细胞中Sec31A 阳性点状结构直径显著增加，表明Lrrk2缺失影响了ERES 的正常形态。本文还利用内质网至高尔基体蛋白运输抑制剂Brefeldin A
（BFA）［6］
分别处理了野生型以及Lrrk2基因敲除小鼠成纤维细胞，结果发现BFA 处理的野生型小鼠成纤维细胞中Sec31A 阳性点状结构直径也显著增加，但是BFA 处理的Lrrk2基因敲除小鼠成纤维细胞中Sec31A 阳性点状结构直径并未进一步增加。以上结果提示Lrrk2缺失导致ER 至高尔基体蛋白输出功能发生异常。
2.Lrrk2表达缺失导致神经元活性依赖的NMDA 受体蛋白向细胞膜输送过程障碍（图2）
。
图2 Lrrk2表达缺失抑制神经元活性依赖的NR2A 蛋白输送至胞膜（c P ＜0.001，n =10）
在Lrrk2+/+和Lrrk2-/-小鼠皮质神经元中表达NMDA 受体亚基GFP-NR2A，并利用NR2A 免疫荧光染标记神经元表面的NR2A（红），细胞内表达的GFP-NR2A 则呈绿。NMDA 受体的在神经元细胞膜表面的分布受到神经元兴奋性的调节［7］，利用河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）处理可降低神经元兴奋性，诱导细胞膜上NMDA 受体水平上调。但是，本研究发现利用TTX 处理Lrrk2-/-小鼠皮质神经元并不能促进NR2A 在细胞膜表面的分布，提示Lrrk2表达缺失会抑制神经元活性依赖的NMDA 受体蛋白输出至胞膜的过程。
讨 论
内质网是蛋白分泌通路上的第一个场所，蛋白质在合成后转入内质网腔，经过修饰和折叠，由在内质网膜上装配的COPII 有被小泡包裹、出芽离开内质网，被运送至高尔基体。内质网上COPII 有被小泡形成的部位被称为ERES ［8］。COPII 也称外被蛋白II，是由多个蛋白组装形成的复合物，构成COPII 有被小泡内层结构的蛋白为Sec23、Sec24，外层结构的蛋白为Sec13、Sec31，COPII 的组装还需要小G 蛋白Sar1参与［9］。此外，在ERES 中还存在一个关键蛋白Sec16，该蛋白对于ERES 的形成和维持以及COPII 有被小泡的组装起到重要作用［10］。Sec16可作为支架募集COPII 有被小泡组装所需蛋白，在体外实验中，有Sec16存在情况下，Sec23/Sec24和Sec13/Sec31均可以有效的被
募集至脂质小体中［11］。在哺乳动物Sec16有两个成员，即Sec16A 和Sec16B，Sec16A 的结构和功能与其他生物中的Sec16相似，而Sec16B 的具体功能尚未阐明［12］。
本课题组前期发现Lrrk2和Sec16A 存在相互作用，且Lrrk2表达缺失会导致细胞内Sec16A 异常弥散分布，无法正常锚定于ERES，提示LRRK2可能通过作用于Sec16A 从而调节ERES 的蛋白输出功能。在本实验中，发现在Lrrk2-/-小鼠成纤维细胞中ERES 的直径明显增大，而内质网至高尔基体蛋白运输抑制剂BFA 处理的Lrrk2+/+成纤维细胞中ERES 的直径也明显增大，这也就提示Lrrk2表达缺失可能也同样阻滞了内质网至高尔基体蛋白运输过程。还观察到BFA 处理的Lrrk2/-小鼠成纤维细胞中ERES 的直径并没有进一步增大，这一现象也就说明Lrrk2和BFA 作用于同一通路，进一步证实了Lrrk2在内质网至高尔基体蛋白运输过程中的重要作用。因此，推测Lrrk2和Sec16A 之间的相互作用能够促进Sec16A
定位于ERES，而Lrrk2表达缺失可能导致Sec16A 无法正常锚定于ERES，从而影响COPII有被小泡在ERES的组装、出芽，抑制内质网至高尔基体之间的蛋白运输。
神经元表面的受体蛋白是神经传递系统的必要组成部分，而受体蛋白在细胞膜表面的定位受到个细胞过程的调节，包括蛋白分泌、胞吞和胞吐以及内体-溶酶体系统介导的降解过程等。谷氨酸递质传递参与运动功能的调节，有证据显示在PD模型中突触内NMDA受体表达量发生了改变［13］。已有研究表明NMDA受体主要依赖于树突中的ERES输出转运至突触表面，且受神经元活性的调节，抑制神经元活
性可使神经元表面的NMDA受体增加［7, 14］。在本实验中，利用TTX处理降低神经元活性，发现Lrrk2-/-小鼠皮质神经元表面的NR2A并未增加，提示LRRK2表达缺失抑制了神经元活性依赖的NMDA 受体蛋白输出至胞膜的过程。Lrrk2对内质网输出蛋白功能的调控可能不仅仅会影响NMDA受体在神经元表面的表达，更有可能会影响纹状体中等有棘神经元中多巴胺受体在细胞膜表面的分布，进而影响运动功能，参与PD病程的发展，这也是在下一步工作中需要研究的问题。
综上所述，本研究发现Lrrk2表达缺失导致ER 至高尔基体蛋白输出功能发生异常，而这种异常会抑制神经元活性依赖的NMDA受体蛋白输出至胞膜的过程。本研究丰富了人们Lrrk2的病理及生理功能的理解，为进一步阐明Lrrk2参与PD发病的机制提供理论依据。
参 考 文 献
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（收稿日期：2019-06-15）
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