对肿瘤抑制蛋白基因P53的siRNA设计

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摘要：siRNA干扰技术作为一种新型的基因沉默技术，因其具有高校、高特异性、低毒性等优点，应用siRNA干扰技术开发新型的靶向药物，已成为药物研究领域中重点发展方向之一。因此，了解siRNA干扰技术对未来药物领域学习有至关重要的作用。本文是利用NCBI的基因库(GeneBank)及两种计算机辅助设计软件对肿瘤抑制蛋白基因P53进行siRNA设计，并对方法和结果进行分析比对。
滑差离合器前言：RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程。其中siRNA是RNAi发挥效应所必需的因子，因此掌握siRNA实验和设计方法非常重要。关于设计siRNA目前尚无可靠的规律，不过，不少实验室和科研机构都开发了相应的siRNA设计软件。设计siRNA设计是一个需要由软件完成的工作，接下来，我将用这两种软件对肿瘤抑制蛋白基因P53进行siRNA设计，并进行分析。
福特车怎么样一、siRNA作用机制
小干扰RNA作为与RNA干扰现象紧密相连的非编码RNA之一，是后基因组时代的重要研究工具。其作用机制首先是进入体内的siRNA双链解开，引导链（指siRNA反义链）进入RNA介导的沉默复合体（RISC），并切断具有序列特异性的mRNA，切断部位大约在与反义链配对序列的中部，然后靶mRNA进一步降解。
二、siRNA设计原理与规则
疲劳驾驶RNAi作用的成功与否，关键在于siRNA序列的结构。不同的siRNA序列沉默基因的效率差别很大。因此，理性设计有效siRNA就成为试验成功的一个关键因素。借助生物信息学手段以选择最佳siRNA，可使用一些筛选模型优化寡核苷酸序列性质，诸如G/C比例，碱基变化以及序列中重复碱基数目。
1、siRNA反义链5’末端碱基设计、siRNA正义链设计、G/C比例
目前, siRNA的设计有两种方法一种以有效序列为依据并应用统计学计算获得的设计规律。Reynolds A等针对2个基因合成了180条siRNA,，通过测定其沉默效率，总结出理性设计有效siRNA的8条原则:：1） GC含量在30%~55%之间；2）有义链15~19位至少有3个A或U；
3） 避免出现倒置重复，会形成发卡； 4) 有义链19位为A；5）有义链3位为A；6）有义链10位为U；7）有义链19位非G或C；8）有义链13位非G。该原则已经被普遍应用于siRNA的序列设计。另一种方法是以siRNA 序列上的能量为依据，筛选可能的有效序列Chalk A M等通过收集文献发表的针对92个基因的有效的siRNA 398条，应用氢键的能量分布规律进行分析，提出: 1）总的siRNA双链能量<1；2）反义链5’端的结合能小于9； 3）有义链5’端结合能在5－9之间； 4）GC含量在36－53%之间；5）中间（7－12）的结合能小于13；6）反义链5’端与正义链5’端的能量差小于0；7）反义链5’端与正义链5’端的能量差最好在－1－0之间 。
2、siRNA目的位置二级结构预测提高siRNA效率
siRNA双链末端不同热力学稳定性，提示哪条链会进入RISC中。双链末端稳定性对于沉默效果预测影响占60％，二级结构预测可改善siRNA位点预测效率，80％的非作用位点可以通过二级结构预测来排除。
3、内部重复序列
因包含内部重复序列或回文序列的siRNA可能形成潜在内部发卡结构或折叠结构，降低了siRNA有效浓度及沉默效力，故siRNA设计时应避免内部重复序列。
三、对P53的siRNA设计过程
1、设计大致步骤
首先，从靶cDNA启动密码子下游50～100bp处开始选择siRNA作用位点。5和3 7非编码区和启始密码子附近区域应尽量避兜一固为这些区域或是编码调节蛋白结合位点、非编码区结合蛋白或翻译启始复合物的区域．它们可能对RISC复合物的形成造成干扰，而削弱RNAi的作用。出启始密码子下游的AA，将连同其后(N19)TT记录下来，即AA(N19)TT，计算这23hp中G和C碱基含量，最好在50％左右(30％～55%之间)。假若碱基序列和G、C台量达不到上进要求，也可AA牙头的21bp，即AA(N21)寡核苷酸。正义链siRNA序列相应就成为(N19)rIr或N21。对于后一种情况，在正义链sirNA序列的3末端加上TT，目的在于确保双链的对称性，使合成出的ds RNA正义、反义链具有3’端突出；最后在NCBl和EST数据库查并确定所设计的靶基曰是唯一的。
2、在GenBank数据库获取P53序列
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3、两种软件上的设计