CELL DEATHAND CELL-CYCLECHECKP OINTDURING DNA DAMAGE
细胞死亡及周期阻滞基本信号通路
有哪些因素可引起DNA损伤？DNA损伤的结局如何？
（课件）
(一)DNA损伤的原因
环境因素，化学因素，生物因素例如： UV ，离子辐射，基因毒性化学试剂引起s s DNA/dsDNA 损伤，DNA两条链交联或链内交联。正常细胞线粒体的一些代谢物（ROS）活泼氧类过多引起损伤。
(二) DNA损伤结局：
急性效应：干扰核酸代谢，触发细胞周期阻滞或死亡
长期效应：不可逆转突变导致肿瘤
细胞周期阻滞，衰老，肿瘤/癌症，有丝分裂危象
(一)DNA损伤的原因
1.DNA分子的自发性损伤
(1)DNA复制中的错误。
(2)DNA的自发性化学变化
a.碱基的异构互变性损伤
b.碱基的脱氨基作用
c.脱嘌呤与脱嘧啶
d.碱基修饰与链断裂
2.物理因素引起的DNA损伤
(1)紫外线引起的DNA损伤
(2)电离辐射引起的DNA损伤
a.碱基变化
b.脱氧核糖变化
c.DNA链断裂
d.交联
3.化学因素引起的DNA损伤
(1)烷化剂对DN A的损伤
a.碱基烷基化
b.碱基脱落
c.断链
d.交联
(2)碱基类似物、修饰剂对DN A的损伤
DNA损伤的后果
1.点突变(pointmutati on)指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤(A与G之间的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C与T之间的替代)称为转换(transi tion)；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换(transv ertio n)。
2.缺失(deleti on)指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。
3.插入(insert ion)指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动(readin g frameshift)，使其后所译读的氨
基酸序列全部混乱，称为移码突变(frame shiftmutaio n)。
4.倒位或转位(transp ositi on)指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。
5.双链断裂已如前述，对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。
（2） THE CONSEQ UENCE S OF DNA INJURY
The outcom e of DNA damage is divers e and genera lly advers e（有害的）. Acuteeffect s arisefrom distur bed DNA metabo lism（新陈代谢）, trigge ring（启动，控制） cell-cyclearrest or cell death. Long term effect s result from irreve rsibl e mutati ons（转变，突变，变异）contri butin g to oncoge nesis（）.
● Many Lesion s（损伤） Block（阻碍） Transc ripti on（转录）— an outcom e direct ly relate d to gene length. This has elicit ed（引出）the develo pment of a dedica ted repair system, transc ripti on-couple d repair (TCR), whichdispla ces or remove s the stalle d RNA polyme raseand assure s high priori ty repair. TRANSC RIPTI ONALSTRESS, arisin g from persis tentblocka ge of RNA synthe sis, consti tutes an effici ent trigge r for p53-depend ent apopto sis, whichmay be a signif icant anti-cancer mechan ism.
●Lesion s Also Interf ere With DNA Replic ation（复制）—Recent ly, a growin g classof DNA polyme rases（聚合酶）, number ed ζ to κ, was discov eredwhichseemsdevote d specif icall y to overco mingdamage-induce d REPLIC ATION AL STRESS. Thesespecia l polyme rases take over tempor arily from the blocke d replic ative DNA polyme rase-δ/ε, and possib ly from pol α . …But this soluti on genera lly comesat the expens e of a higher errorrate. In fact, this proces s is respon sible for most of damage-induce d pointmutati ons and is thus partic ularl y releva nt for oncoge nesis. Nevert heles s, transl esion polyme rases stillprotec t the genome.
●Double-strand DNA breaks(DSBs) induce d by X-rays, chemic als or during replic ation of single-strand breaks (SSBs) and presum ablyduring repair of inters trand crossl inksare partic ularl y releva nt for the recomb inati on machin ery.
Eg：Cellswith specia lized DNA recomb inati on activi ties,such as B- and T-cells,may be very sensit ive to DSBs when they are rearra nging theirimmuno globi n or T-cell-recept or genes.This explai ns the freque nt involv ement of thesegeneti c loci in oncoge nic transl ocati ons in leukae mia(白血病) and lympho mas（淋巴瘤） and the prefer entia l induct ion of thesecancer s by ionizi ng irradi ation.
Eg：DSBs also pose proble ms during mitosi s（有丝分裂）, as intact（未受损的） chromo somes are a prereq uisit e（先决条件） for proper chromo somesegreg ation（分离） during cell divisi on. Thus, theselesion s（损伤） freque ntlyinduce variou s sortsof chromo somal aberra tions（染体病）, includ ing aneupl oidy（）, deleti ons（缺失） (loss of hetero zygos ity, LOH) and chromo somal transl ocati ons（迁移，置换）— events whichare all intima telyassoci atedwith carcin ogene sis （癌变）.
●The cell-cyclemachin ery someho w senses genome injury and arrest s（阻滞）at specif ic checkp oints in G1, S, G2 and M to allowrepair of lesion s before they are conver ted into perman ent mutati ons. Lesion detect ion may occurby blocke d transc ripti on, replic ation or specia lized sensor s. When damage is too signif icant, a cell may opt for the ultima te mode of rescue by initia ting（开始）apopto sis（凋亡） at the expens e of a wholecell
什么分子可作为DNA双链断裂/损伤的标志？用什么方法测定？
（1）Senesc ence(衰老), can be trigge red when telome res（端粒）—the ends of linear chromo somes—cannot fulfil（执行）theirnormal protec tivefuncti ons. Here we show that senesc ent humanfibrob lasts（纤维原细胞）displa y molecu lar marker s charac teris tic of cellsbearin g DNA double-strand breaks.
Thesemarker s includ e nuclea r foci of phosph oryla ted histon e H2AX and theirco-locali zatio n with DNA repair and DNA damage checkp ointfactor s such as 53BP1, MDC1 and NBS1. We also show
that senesc ent cellscontai n activa ted formsof the DNA damage checkp ointkinase s（激酶，致活酶）CHK1 and CHK2.
（2）fluore scenc e（荧光）
DNA发生双链断裂后最早反应之一是位于断裂点附近的组蛋白H2A X的C末端第139位丝氨酸残基被快速磷酸化形成γ-H2AX。磷酸化的γ-H2AX快速转导DNA损伤信号，导致下游分子磷酸化的激活，引发一系列的生物级联反应和和细胞学反应。γ-H2AX是迄今所研究的最重要的D N A损伤感应分子。免疫印记法检测。
基于双链断裂/损伤，常在有丝分裂过程出现问题，引起各种类型染体畸变，包括非整倍体，缺失和染体异位的发生，也用流式细胞仪做细胞倍体检查。
采用PFGE法（脉冲场凝胶电泳法）测定链断裂量，以孔外进入凝胶的DNA占孔外和孔内总DNA比例FAR（DSB FAR（%））。
用FITC-结合抗生素蛋白检测DNA损伤。
写出G1、G2/M checkp oint基本信号通路主要分子成分。
● G1-phaseCheckp ointPathwa y
ATM-CHK2-CDC25A-CDK2 axis formsa rapidrespon se system;
ATR-CHK1-CDC25A-CDK2;
CDC25A-CDK4;
ATM-CHK2/ATR-CHK1-P53-p21 pathwa y
● S-phaseCheckp ointPathwa y
ATM-CHK2-CDC25A-CDC45axis formsa rapidrespon se system
● G2/M-phaseCheckp ointPathwa y
A key effect or of G2 checkp ointis CDC2 (CDK1) :
ATM-CHK2- CDC25C-CDC2 axis
ATR-CHK1- CDC25C-CDC2 axis
ATR-CHK1- CDC25A-CDC2 axis
Weel-CDC2 inhibi tion
PLK1 (-) and PLK3 (+) (polo-like kinase family) play a crucia l rolesin initia tionand exit from mitosi s P21-PCNA-CDC2-Cyclin B comple x exclud es CDC25C(-)
PCD(程序性细胞死亡)都有哪些形式？PCD主要形态学特征如何？
I（凋亡Apoptosis）；
Morpho logy: Chroma tin conden satio n, fragme ntati on, apopto tic bodies
II型（自噬Autophagi c）
Trigge rs: Serum/amino-acid starva tion, protei n aggreg ates
(3)Type III PCD——Atypic a(非典型性)l formsof cell death: Parapt osis(Aponec rosis)
Morpho logy:ER swelli ng, mitoch ondri al swelli ng(胞浆空泡化，线粒体，内质网肿胀，无核固缩)
(4)Type IV PCD—— Calciu m-mediat ed cell death（钙离子介导的细胞死亡）
Morpho logy: Membra ne whorls
(5)Type V PCD ——AIF/PARP-depend ent cell death（AIF/PARP依赖性细胞死亡）
Morpho logy: Mild chroma tin conden satio n
(6)Type VI PCD——Oncosi s （胀亡）
Morpho logy: Cellul ar swelli ng
形态学变化:
首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA 降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗
骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。
其基本信号通路所涉及的主要激活分子是什么？如何检测或鉴定？各有何意义？
凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspas e家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等，
1）细胞凋亡的膜受体通路
Fas(CD95)是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，它与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡
2）细胞素C释放和Cas pases激活的生物化学途经
细胞素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤, 线粒体还释放凋亡诱导因子，如AIF，参与激活ca spase(半胱天冬蛋白酶)
Fas
是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员, Fas又称C D95，是由325个氨基酸组成的受体分子，Fas一旦和配体Fas L结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面
Caspas e
是半胱氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspa se基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括casp ase2,3,6,7,8,9.10。细胞凋亡的过程实际上是Caspa se不可逆有限水解底物的级联放大反应过程. 参与诱导凋亡的Casp ase分成两大类：启动酶（initit aor）和效应酶（effect or）它们分别在死亡信号转导的上游和下游发挥作用。
细胞素C
在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使cas pase-9与其结合形成凋亡小体
AIF
凋亡诱导因子，参与激活ca spase
凋亡抑制因子：
P35，CrmA,IAPs，FLIPs以及Bcl-2家族
P35和Cr mA
是广谱凋亡抑制剂，体外研究结果表明P35以竞争性结合方式与靶分子形成稳定的具有空间位阻效应的复合体并且抑制Cas pases活性
FLIPs(FLICE-imhibi roryproter ins)
能抑制Fas/TNFR1介导的细胞凋亡
s.b.polo凋亡抑制蛋白（IAPs,inhibi torsof Apopto sis protie n）
为一组具有抑制凋亡作用的蛋白质
Bcl-2
生理功能是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命
1．早期检测：
1）PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测：PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生，可能作为免疫系统的识别标志，通过简单的显或发光系统进行检测2）细胞内氧化还原状态改变的检测：通过荧光染料monoc hloro biman e（MCB）体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化
3）细胞素C的定位检测：从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Wester n杂交用细胞素C抗体和CO X4抗体标示细胞素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。
4）线粒体膜电位变化的检测：MitoSe nsorT M，一个阳离子性的染剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号
2．晚期检测
1） TUNEL（Termin al deoxyn ucleo tidyl transf erase-mediat ed dUTP nick-end-labeli ng）
通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接（通过）或直接接到D NA 片段的3’-OH端，再通过酶联显或荧光检测定量分析结果
2）LM- PCR
3） Teleme raseDetect ion （端粒酶检测）
3．mRNA水平的检测：荧光定量PC R技术
4.细胞凋亡的形态学检测
1．光学显微镜和倒置显微镜: 未染细胞；染细胞：
2．荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
3．透射电子显微镜观察
意义：细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。在胚胎发育阶段通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞，保证了胚胎的正常发育；在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康。和细胞增殖一样细胞凋亡也是受基因调控的精确过程，在这一节我们就细胞凋亡的分子机理作简要的介绍。
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