组织样品DNA的提取
(QIAamp DNA Mini Kit)
实验前注意：
⏹样品保持于室温（15-25℃）
⏹准备好水浴两组：一组56℃用于步骤3，一组70℃用于步骤5
⏹步骤11中用于洗脱的Buffer AE和蒸馏水保持于室温（15-25℃）
⏹Buffers AW1 and AW2按照17页说明准备
⏹如果Buffer ATL或AL中有沉淀形成，则于56℃中水浴以溶解之
具体步骤：
1.切割组织样品。应少于25mg（脾组织则少于10mg）。
DNA产量与组织类型和大小有关。一般，1mg组织可得到大约0.2-1.2μg的DNA。
（研磨）将25mg组织置于液氮中，充分研磨后倒入2ml离心管中，加入180μl Buffer ATL。此过程中，液氮可以挥发，但组织不能融化。
（匀浆处理）将25mg组织置于2ml离心管中，加入不超过80μl的PBS，匀浆器处理。加入100μl Buffer ATL。
Buffer ATL不稀释时，推荐（研磨）。
3.加入20μl proteinase K，振荡处理20s，56℃水浴至组织完全裂解。
proteinase K必须使用，因为QIAGEN Protease在Buffer ATL存在的情况下活性已降低。裂解时间视组织块大小而定，通常1-3h即可完全裂解。过夜处理是合理的，无不良影响。为保证裂解效率，应使用振荡水浴或者振荡台。
领克是国产的还是合资4.短时离心，以去除离心管盖内沿液体。
5.加入200μl Buffer AL，振荡15S，70℃水浴10min。短时离心，以去除离心管盖内沿液
体。
加入Butter AL后，可能会产生白沉淀物，70℃水浴中大都可以溶解。这些沉淀物对于抽提过程和后续实验没有影响。
6.加入200μl乙醇（96%-100%），振荡15s，短时离心，以去除离心管盖内沿液体。
加入乙醇后，可能会产生白沉淀物。这些沉淀物对于抽提过程和后续实验没有影响。
7.小心将以上所得混合液（包括沉淀物）小心加入到QIAamp Mini spin column中（without wetting the rim）将离心柱放入2ml收集管中。盖紧离心管盖，以6000×g（8000rpm）离心1min。将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中（试剂盒提供）。丢弃收集管及其中液体。
6000g（8000rpm）离心是为了减少噪音，最大速度离心不影响DNA产量和纯度。务必使所有溶液进入到收集管，如没有，则需再次以更高速度离心直至所有溶液进入收集管。
8.小心加入500μl Buffer AW1到QIAamp Mini spin column中（without wetting the rim）
。盖紧离心管盖，以6000×g（8000rpm）离心1min。将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中（试剂盒提供）。丢弃收集管及其中液体。
9. 小心加入500μl Buffer AW2到QIAamp Mini spin column中（without wetting the rim）。盖紧离心管盖，以20000×g（14000rpm）离心3min。将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中（试剂盒提供）。丢弃收集管及其中液体。
10.推荐：将QIAamp Mini spin column置入一支新的2ml收集管中（自备），丢弃收集管及其中液体。国产奥迪a6l全速离心1min。
此步是为了防止Buffer AW2残留。
11. 将QIAamp Mini spin column置入一支洁净1.5ml收集管中（自备），丢弃收集管及其中液体。小心在QIAamp Mini spin column中加入200μl Buffer AE或蒸馏水。室温下静置1min，6000×g（8000rpm）离心1min。
12.重复step 11之离心操作。将收集管盖好，保存于-20℃。
血浆样品DNA的提取
(QIAamp DNA Mini Kit)
实验前注意：
⏹样品保持于室温（15-25℃）
⏹准备好水浴56℃用于步骤4
⏹步骤11中用于洗脱的Buffer AE和蒸馏水保持于室温（15-25℃）
⏹Buffers AW1、AW2以及QIAGEN Protease按照17页说明准备
⏹如果Buffer AL中有沉淀形成，则于56℃中水浴以溶解之
具体步骤：
1.于1.5ml离心管底部加入20μl QIAGEN Protease（或proteinase K）
2.离心管中加入200μl血浆
3.加入200μl Buffer AL，振荡15s
注意：不可将QIAGEN Protease或proteinase K 直接加入到Buffer AL中。若样本量较大，则QIAGEN Protease和Buffer AL按比例增加。
4.56℃水浴10min
DNA产量在此过程中达到最大值，增加水浴时间不能增加产量。
5. 短时离心，以去除离心管盖内沿液体。
6. 加入200μl乙醇（学车视频教程96%-100%），振荡15s，短时离心，以去除离心管盖内沿液体。
若样本量较大，则乙醇按比例增加。
7. 小心将以上所得混合液（包括沉淀物）小心加入到QIAamp Mini spin column中（without wetting the rim漯河市限号2021最新限号）将离心柱放入2ml收集管中，盖紧离心管盖，以6000×g（8000rpm）离心1min。将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中（试剂盒提供）。丢弃收集管及其中液体。
6000g（8000rpm）离心是为了减少噪音，最大速度离心不影响DNA产量和纯度。务必使
所有裂解物进入到收集管，如没有，则需再次以更高速度离心直至全部进入收集管。
8. 小心加入500μl Buffer AW1到QIAamp Mini spin column中（without wetting the rim）。盖紧离心管盖，以6000×g（8000rpm）离心1min。将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中（试剂盒提供）。丢弃收集管及其中液体。
即使最初加入的样本多于200μl，也没有必要增加Buffer AW1的用量。
9. 小心加入500μl Buffer AW2到QIAamp Mini spin column中（without wetting the rim）。盖紧离心管盖，以20000×g（14000rpm）离心马自达3二手车3min。
10.推荐：将QIAamp Mini spin column置入一支新的2ml收集管中（自备），丢弃收集管及其中液体。全速离心1min。
此步是为了防止Buffer AW2残留。
11. 将QIAamp Mini spin column置入一支洁净1.5ml收集管中（自备），丢弃收集管及其中液体。小心在QIAamp Mini spin column中加入200μl Buffer AE或蒸馏水。室温下汽车新政策（15-25℃）静置1min，6000×g（8000rpm）离心1min。将收集管盖好，保存于-20℃。
发布评论