• 158 •国际流行病学传染病学杂志2021年4月第48卷第2期Inter J Epidemiol Infect Dis，April 2021，Vol. 48，N〇.2
铜绿假单胞菌P c rV疫苗的研制现状
李文桂陈雅裳
重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所400016
通信作者：李文桂，E m a i l:c q liw e n g u i@163.c o m
•综述•
【摘要】铜绿假单胞菌是一种院内感染的常见致病菌，采用疫苗防治该菌是当前研究的热点领域之一。PcrV
PcrV抗体、核酸疫苗以及重组鼠伤寒沙门菌疫苗等的研究现状，为新型疫苗研发提供参考。
【关键词】假单胞菌，铜绿;PcrV蛋白；疫苗；转运蛋白；抗体
基金项目：国家自然科学基金（30801052、30671835、30500423、30200239)
D0I ： 10.3760/cma.j331340-20200623-00205
Recent advances in PcrV vaccine against Pseudomonas aeruginosa
Li Wengui, Chen Yalong
Institute o f Infectious and Parasitic Diseases^ the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing
400016, China
Corresponding author \ Li Wengui, Email ：******************
【Abstract】Pseudomonas aeruginosa is one type of pathogens causing nosocomial infections. It recently
becomes highlight to control this bacterium by the application of related vaccine. PcrV protein, as a tr
ansport protein,
is an important target for immune regulation and an effective candidate molecule of vaccine. The review outlines the
research of PcrV protein, PcrV antibody, nucleic acid vaccine, and recombinant Salmonella typhimurium vaccine, in
order to provide references for the development of novel vaccine.
【Key words】aenxgifwwa; PcrV protein; Vaccine; Transport protein; Antibody
Fund program：National Natural Science Foundation of China(30801052, 30671835, 30500423, 30200239)
DOI ： 10.3760/cma.j331340-20200623-00205
铜绿假单胞菌是一种常见的机会致病菌'I D型分泌系 统(T3SS)是其主要致病因子，可协助其逃避巨噬细胞的吞噬和降解|21。其中PcrV蛋白是一种T3SS的转运蛋白，可将细菌 产生的毒素蛋白转运至宿主细胞内，干扰细胞的功能，引起 细胞死亡提示PcrV蛋白作为免疫调控靶点是一种有希望的疫苗分子。
本文拟就PcrV蛋白分子、PcrV抗体、核酸疫 苗以及重组鼠伤寒沙门菌（St)疫苗等的研制现状进行综述。
—、PcrV蛋白
弗氏佐剂（FA)是一种水包油制剂，完全FA(CFA)含有 失活的分枝杆菌，不完全FA(IFA)则不含有，两者都能增强机体的免疫应答I Sawa等w将10 (jig重组PcrV抗原加FA 皮下注射BALB/c鼠，注射后3周皮下注射S x lF C F U铜绿 假单胞菌PA103株进行攻击，在攻击后1周发现肺组织的病变减轻，肺组织的细菌负荷下降，免疫组和对照组计数存活率分别为70%和0。H o ld e r等171将10 j i g重组P c rV抗原加FA 肌肉注射CF-1鼠，在首次注射后2周加强1次，在首次注射 后3周显示血清IgG升高，4周后制作15%体表面积的烧伤模型，同时皮下注射5x10s C F U铜绿假单胞菌M-2株、SBI-N 株和1071株进行攻击，在攻击后1周显现3个攻击组焦痂和肺组织的细菌负荷显著降低，M-2攻击组、S B I-N攻击组 和1071株攻击组的存活率分别为80%、60%和40%，而对照 组为0。M oriyam a等间将30 jx g截短型P c rV抗原加F A皮下 注射B A L B/c鼠，在首次注射后30 d加强1次，在首次注射后60 d腹腔注射5 m g环磷酰胺诱导小鼠的中性粒细胞减少，在首次注射后63 d腹腔注射5x l06C F U铜绿假单胞菌P A103株进行攻击，在攻击后3d提示PcrV^M免疫组和PcrV a#免疫组的存活率均为65%，而PcrV ,3^34免疫组和P c rV%#免疫组均为20%；被动免疫试验提示PcrV,^和
国际流行病学传染病学杂志2021年4月第48卷第2期丨nler J Epidemio丨丨nfect Dis. Apri丨2021，V o丨.48,No.2•159.
PcrV13»_M免疫组60 d的抗血清可产生较好的保护力。
铝佐剂是美国FDA批准用于临床的佐剂之一，对DC、T 细胞和B细胞具有明显的刺激作用，主要诱导宿主产生Th2 型的免疫应答191。Markham等叫将10ixg重组PcrV抗原加铝 佐剂肌肉注射BALB/c■鼠，显现血清丨g G在注射后1~7周升 高，在注射后3周达较高水平。
C pG寡脱氧核苷酸序列（CpG ODN)是一种人工合成的核酸佐剂，可以模拟细菌DNA，促进免疫细胞表达TLR9受 体，产生细胞因子，主要诱导T h l型的免疫应答1"1。Naito等M 将10叫重组PcrV抗原加10 p g的CpG 0
D N核酸佐剂滴鼻接种IC R鼠，在初次接种后2和3周各加强1次，初次接 种后50 d显7T：血清IgG、I g G l和IgG2a升高，Ig G l与丨gG2a 比值大于1，支气管肺泡灌洗液的IgA升高；初次接种后55 d 通过支气管注射的途径将1.5xl06 CFU铜绿假单胞菌PA103 株进行攻击，攻击后7 d发现免疫组的肺组织病变减轻，细菌 负荷减少，免疫组和对照组计数存活率分别为73%和0。
尼桑阳光汽车Hamaoka等1|31将10 |x g重组PcrV抗原加FA、铝佐剂和0D N佐剂分别滴鼻接种IC R鼠，初次接种后2
0和40 d各加 强1次，初次接种后60 d证实血清IgG、丨gG丨和IgG2a升高，Ig G l与IgG2a比值大于l,65d通过气管内注射将1.5xl06CFU 铜绿假单胞菌PA103株进行攻击，在攻击后1d发现免疫组 的肺组织水肿显著减轻，肺组织内的过氧化物酶减少，肺组 织的细菌负荷减少，在免疫后7 d证实PcrV抗原加FA组、PcrV抗原加铝佐剂组和PcrV抗原加0D N佐剂组的存活率分别为90.9%、81.8%和40.0%，而对照组为0。
H氧十二烷酰高丝氨酸内酯丨3-OXO-C12-HSL]是密度感 应系统LasRI和RhlRI蛋白的诱导剂，可以调节铜绿假单胞 菌毒力因子的表达，影响宿主的免疫应答M。Golpasha等M将 10 (xg重组PcrV抗原加10 p g的3-OXO-C12-HSL佐剂皮下 注射BALB/c鼠，在初次接种后2和4周各加强1次，6周后 显示血清IgG、lg G l和IgG2a升高，I g G l和IgG2a比值大于1,7周后皮下注射5xl02CFU铜绿假单胞菌PA01株进行攻 击，在攻击后丨周显示免疫组的肝脾肾组织的细菌负荷是对照组的1% ，免疫组和对照组计数存活率分别为78%和0。
溶血素共调节蛋白1(HCP1)是一种依赖T6S S的细胞内 效应转运蛋白，可将毒素蛋白转运至宿主细胞内M。Yang等||7>以PA01株的基因组DNA为模板扩增PcrV28-294、OprI25- 83和HCP11-162基因，将它们融合为P0H基因，插人 pGEX-6P-2，得pGEX-POH。将30 (xg融合蛋白加铝佐剂肌肉 注射BALB/c鼠，初次接种后2和3周各加强丨次，5周发现 血清Ig G J g G l和lgG2a升高，丨g G l与IgG2a比值大于1，睥 细胞明显增殖，并分泌高水平IL-4、IFN-7和IL-17A等细胞因子，此时用5xl06CFU铜绿
假单胞菌PA01株进行气管内 注射攻击，在攻击后1d显示免疫组的肺组织病理减轻，支气 管肺泡灌洗液中TNF-ct、I L-ip和IL-6水平降低，在攻击后
7 d发现免疫组和对照组计数存活率分别为60%和0。
二、重组P crV抗体
PcrV抗体结合PcrV后可阻断铜绿假单胞菌毒素蛋白的释放，从而提高宿主的抵抗力，但用PcrV抗体铜绿假单胞菌感染存在一定的毒副作用，这就需要改造PcrV抗体，降 低其免疫原性和毒性Frank等M和管章春等W先后制备了 PcrV的单克隆抗体，体外试验表明它们均具有较好的抗铜绿假单胞菌活性。Neely等M制作15%体表面积的C F-1鼠烧伤 模型，在烧伤后l h皮下注射103CFU铜绿假单胞菌SBI-N 株、1071株和M-2株进行感染，感染后1、2和3d腹腔注射 100 (ig的PcrV-IgG进行免疫后1周显示SBI-N攻 击组、M-2攻击组、1071攻击组和对照组的存活率分别为90%、80%、30%和0。W ang等间将5xl06 CFU铜绿假单胞菌R4株加10 |xg的PcrV-IgG支气管内注射BALB/c鼠，然后口 服500 mg/kg的头孢他啶，1次/d，连服7 d，在后7 d发 现抗体组的肺组织病理减轻，肺细菌负荷是对照组的1%，计数存活率提示抗体组和对照组分别为100%和0。
鸡蛋黄IgG(IgY)是一种经济有效的多克隆抗体，对耙抗 原的亲和力高，可以阻断铜绿假单胞菌与宿主上皮细胞的相互作用^R a n jb ai■等1341将100邮的PcrV-IgY腹腔注射BALB/c 鼠，在抗体注射后2 h用
2xl07CFU铜绿假单胞菌PA01株进 行滴鼻感染，感染后7 d计数存活率表明IgY组和对照组分别为70%和0。
三、PcrV核酸疫苗
铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)具有较强的免疫原性，将 其免疫小鼠可产生较好的保护力^51。Jiang等I*1以PA01株的 基因组DNA为模板扩增PEA和PcrV基因，分别插人pIRES 的2个位点得pIRESPEA-PcrV，将100 (jLg重组质粒加15 |xg 的CpG ODN1826核酸佐剂肌肉注射BALB/c鼠，在初次接种 后2和4周各加强1次，6周后血清IgG升高，脾细胞明显增 殖，并分泌高水平的IFN-7和IL-12，但丨L-10和IL-4的分泌 水平降低，此时用5xl07 CFU铜绿假单胞菌PA01株进行滴 鼻攻击，在攻击后3 d提示免疫组脾和肺的细菌负荷均显著降低。
鞭毛的基本组成单元为鞭毛蛋白（F la),F la可诱导宿主 产生中和抗体，是一种有效的免疫原网。S aha等™将PcrV、PilA、0p rF-I的编码基因分别插人pGACAG获得pCACAG- PcrV/PilA/OprF-I，各取1p g的重组质粒组成混合DNA疫 苗；采用基因轰击法接种BALB/c•鼠，在初次接种后2周加
强1次，初次接种后4周提示血清IgG和Ig G l升高，此时用 5xl05CFU铜绿假单胞菌D4株进行滴鼻攻击，攻击后1d显 示免疫组支气管肺泡灌洗液内的中性粒细胞和巨噬细胞增加，M IP-2和IFN-7mRNA的转录水平升高，攻击后10 d提 示免疫组和对照组的存活率分别为100%和0。
四、S t减毒株介导的P crV疫苗
S t的减毒株主要用于伤寒和副伤寒的免疫防治。Aguilera-Herce等[29]分别以PA01株和S t的14028株基因组DNA为模板分别扩增PcrV和S seJ分泌序列，将基因
插人pGEX-4T-2 获得pGEX-PcrV，将S m*/基因插人pGEX- PcrV 获得pGEX-PcrV-SseJ，与pWSK29 重组获得pWSK29- PcrV-SseJ；将重组质粒电穿孔转化S tl4028株，筛选阳性重组 菌，免疫印渍提示阳性血清识别重组菌表达的PcrV融合蛋 白（相对分子质量为35 000)。将2><1050?11疫苗腹腔注射C57BL/6鼠，在注射后3周提示血清IgG升高，脾细胞分泌高 水平的T N F-a和IL-6，此时腹腔注射9xl06 CFU铜绿假单胞 菌PA01株进行攻击，在攻击后7 d提示免疫组肺和脾的细菌负荷下降，免疫组和对照组计数存活率分别为75.0%和
12.5%〇
五、结语
现有铜绿假单胞菌PcrV蛋白疫苗产生的保护力通常较低，常须k用佐剂或与其他抗原进行融合表达才能诱导有效的保护力；PcrV抗体具有被动保护作用，但不良反应较大；核 酸疫苗可诱导全面的细胞和体液免疫应答，但其有整合进宿 主基因组的风险；重组S t疫苗的表达产物与天然蛋白存在差 异，表达水平较低。
随着核基因组学、泛基因组学、蛋白组学、高通量测序和 反向疫苗学等技术的发展，人们将对铜绿假单胞菌的基因组学、蛋白质组学以及代谢组学进行深人研究，从而发现PcrV 蛋白的结构与功能的关系；为了增加DNA疫苗的免疫原性，对PcrV抗原表位的序列进行修饰，构建PcrV多抗原表位或免疫增强序列-P crV抗原表位的融合基因疫苗，构建PcrV表 位-佐剂序列或不同抗原表位序列的融合基因疫苗。同时应 积极开展新型疫苗载体的探索，将它们联合起来，推动铜绿 假单胞菌PcrV疫苗的研究跃上一个新的台阶。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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(收稿日期：2020-06-18)
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