环境昆虫学报2021, 43 (3)： 676 -683Joereal p Exviroeuedat Extonology
htt p ： 〃hjkcxb. aXjouoaU. net
doi ： 10. 3969/j. im s 1674 -0858. 2021. 03. 17
虫学报，2021, 43 （3） : 676 -683.
提取物对香烟引起 化 的 效果：
王 钦"，伏 蓉"，隋世燕…，王惠玲，杨溢萍，蒋淋源，段 雷
（大理大学公共卫生学院；大理大学云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理671000）
摘要：美洲大赚提取物具有显著的抗肿瘤、抗菌和抗肝纤维化等作用，但是，其对肺脏抗氧化应激效果的研究未 见报道，本文主要探
大 醇提取物对熏烟小鼠血液和肺脏 化应激的效果。选用雌性KM 小鼠28只，
随 为对照组、熏烟组、低剂量和高剂量 大赚醇提物 7只，除对照 盐水外，其他各组每天
中午和下午采用烟熏 ，持续31 d ， 中17天
剂量和低剂量组每天
大赚醇提物， 结
束后计算肺脏系数，检测血浆和肺脏组织匀浆中MDA 、SOD 、CAT 、NO 、GSH-Px 和肺脏SOD 、GSH-P x 、CAT 基 因mRNA 表达的水平以及肺脏组织病理结构的变化。结果表明：各组间肺脏系数和血浆、肺脏中总SOD 和CAT 的
统计学意义（P>0.05），但是与对照 ，熏烟 了血浆和肺脏中NO 以及肺脏中MDA
的含量，显著降低了血浆中GSHP _的活力和肺脏中该基因表达，差异具有统计学意义（P<0.05）；而与熏烟组
， 剂量和高剂量 大k 醇提物
了血浆和肺脏中NO 和MDA 的水平，
了肺脏
GSHP _的活力及其基因表达，高剂量组还显著升高了血浆中GSHP _的活力，差异均具有统计学意义（P<0.05）；
高剂量 大赚醇提物还对香烟造成的肺组织损
缓 用。研究结果表明 大 醇提取物对熏烟小鼠
血液和肺组织 的 化应激功能。
关键词： 大 醇提物；熏烟；氧化 激；基因表达；肺组织病理结构；干预效果中图分类号：Q968. 1 ； Q969.9； S899. 9
文献标识码：A
文章编号：1674 -0858 （2021） 03 -0676 -08
Intreverhon effect of Periplaneta americana ethanol extrach on oxidativr stress it lung of mice by cigarette smoke
WANG Qin *
*，FU Yong *，SUI Shi 异an **，WANG Hui-Ping ，YANG Yi-Ping ，JUNG Lin 异uan , DUAN Lai （ Yunnan Provincial Keg Laboratop of Entomoloyicxi Biophamiaceuticxi R & D , Col W ga of Public Health ，Dali University ，Dali 671000，Yunnan Previnca ，China ）阿尔法罗密欧8c
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31760719）；大理大学2018年大学生科研基金项目（KYSX2018012）
*为共同第一作者'王钦，女，1994年生，在读硕士研究生，从事营养生殖机理研究，E-mail ： *****************；伏蓉，女，1997年 生，在读硕士研究生，从事营养生殖机理研究，E - mail ： 1650781622@ qq. com
**通信作者A u thcr Or correspondence ：隋世燕，男，博士，副教授，主要从事动物营养生殖生理方面的研究，E - mail : sysui569@ 163. com 收稿日期 Receded ： 2020 -03 -25 ；接受日期 Accepted ： 2020 —04 —28
Abstrach : Tha ethanol extract of PeUplaxeta americana （ EnW 紫）has signifOxnt effects of anO-tumer ，
anti-bacteaiaaand anti-hepaticeibao9i ， buttheae9eaach on it p aot ecti ee e e ect again9t oxidati ee9t ae 9in tha lung has net been reported yet. Thg papar mainly discussed tha ot/oxidoion stress eWect of Entv-A
on tha blood and lung of smoking mdv. Twenty-eighfemaiv KM mda wera randomly divided into 4 groups
accaOing to body weight : Control goup ， smoking goup ，Ww-dosa and hgh-dosa Entv-A goup ，with 7 mic:in :ach gaoup.Apaateaom contaoagaoup which wasgie:n intaagastaicadministaation oesaain:， th:
mica in tha othar thov goups wera taxWd by mmipation evep noon and aOrnoon Or 31 day
s ， and tha Entv-A was given inWagast/e administration ever- evening Oom tha 17W day of smoking in low-dosa
and
3王钦等：美洲大燥乙醇提取物对香烟引起小鼠肺脏氧化应激的干预效果研究677
high-dosv ynup.Al Iasi,tha luny xW O Vil was cXculml,and MDA,SOD,CAT,NO and GSH-Lx were detected in plasma and luny homoyenates.Tha mRNA expression livis of SOD,GSH-Ex,CAT of aunghomogenaiesin miceand hisiopaihoaogicaachangesoVaungii s ueweeeaasoiesied.Theeewasno sCCstSoi diSwica of luny coelicieni and activity of total SOD and CAT in plasma and luny homoyenatvs between ymups(P>0.05),bui compared with tha control ynup,tha smokiny ynup had highas conteni of NO in plxma and luny and MDA in luny,which was accompanied by lowar GSH-L x activity in plxma and iismRNA aeeeain aung.Compaeed wiih ihesmokinggeoup,iheaow-doseand high-dosegeoup had Wwas conteni of NO and MDA in plasma and luny,which was associated with highas GSH-L_activity and is mRNA level in luny.In addition,tha high-dosv ynup siyniicontiy incmxl tha vitality of GSH-Lx in plasma.Tha diference was statisticol i y siyniiconi(P<0.05)-High-dosv ynup con also aXaviaiv luny Sssua damaya coused by cigarette.Thio resulis suggested thai tha ethanol ex
tract Wccec played agood aniioiidanisiee s eoaeon ihebaood and aungii s ueoesmokingmice2
Key words:PeWplceetc cmeWccec alcohol liaci；smoka；oxidative stress；yiv expression；patholoyicol chanyas of luny Sssuvs;inCmention Wfeci
吸烟已成为继高血压之后的全球第二号健康杀手，是导致心脑血管疾病、慢性阻塞性肺病和癌症等多种疾病的重要的危害因素，是引起肺癌最重要的危险因子（曹超，2012）o《中国吸烟危害健康报告》曾指出，吸烟者的平均寿命会比不吸烟者减少10年。有研究发现，被动吸烟者暴露在致癌物质中的风险比直接吸烟者高2.5倍（Anderson et cl.,2012）。吸烟与机体氧化应激存在高相关性，能够诱导生命体抗氧化能力下降（曹超，2012）o
自由基是生物体内涉及电子传递生化过程中的一种正常的代谢产物，是机体防御系统的组成部分，但是如果体内自由基产生的过多或者清除的过慢，多余的自由基会通过攻击细胞中的生命大分子物质，造成机体组织或细胞产生氧化应激，进而诱发疾病（张成桂等，2010）。机体有两套防御系统来对抗氧化应激（Wathas et at,2007），其中化，部的化统，属于一级防御系统，可以直接清除氧化应激产生的活性氧或抑制其氧化。包括过氧化物酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-L c）及超氧化物歧化酶（SOD）等，常见的机体氧化应激标志物有丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO），它们能够反映机体脂质过氧化的程度（Baychi et at, 1997）。
美洲大®S PeWplceetc cmeWccec，俗称嶂螂、小强，食性比较广泛，能够传播病菌，其粪便和分泌物中还含有致癌物质，属世界性害虫，但其体内具有抗肿瘤、促进血管增生和组织修复、抗菌、抗肝炎等活性物质（张成桂等，2010）。美洲大赚乙醇提取物能够降低肝脏组织的MDA水平和提高SOD、GSH-L c的水平，提示美洲大赚提取物能够抑制肝脏组织脂质过氧化反应的作用（隋世燕等, 2017）。在力竭运动过程中，美洲大赚提取物可以提高抗氧化酶GSH-L c和SOD的活性，降低MDA 的含量，同时又可刺激血管内皮氧化应激相关基因eNOS的表达，降低心肌组织中脂质过氧化的水平，延长了大鼠力竭运动时间，实现其抗运动性疲劳的目的（马俊等，2015）；还能使大鼠血中MDA和NO含量显著减少（隋世燕等，2017）。说明美洲大赚乙醇提取物具有显著的抗氧化功能，但是，其在吸烟引起的小鼠肺氧化应激中是否有缓解效果还不清楚。
本研究将建立小鼠被动吸烟模型，然后给予不同浓度的美洲大赚醇提物，分别检测小鼠血浆和肺脏中NO、MDA的含量以及SOD、CAT、GSH-Px 的活力，并检测相关基因表达的水平，结合肺脏病理切片，探讨美洲大赚醇提物对被动吸烟引起小鼠肺化激的干预效果，为大醇取
物在这方面的生产应用和药物开发提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1物
选择性成熟雌性KM小鼠28只，体质量18-
678环境昆虫学扌&Journal p Exviroxneyiat Entomology43
22g，实验动物来自第三军医大学，生产许可证号：SCXK（渝）2007-017，使用许可证号：SCXX （滇）2005-0010。适应性喂养3d后随机分为4组，每组7只；由于试验期间灌胃操作不当死亡4只，采样时对照组6只、熏烟组5只、低剂量组7只、高剂量组6只。
1.1.2美洲大赚醇提物的制取
美洲大赚成虫处死后，晾干、粉碎，用15倍质量的95%乙醇进行冷浸提取3次，蒸发浓缩后的浸膏放入-40k冰柜保存备用（隋世燕等, 2017）。
1.1.3香烟选择
选取云烟品牌中的“云烟（紫）”作为本实验用烟，烟长84mm，软包装，每包20只，含焦油13mg，尼古丁1.2mg。
1.1.4
对照组处于正常环境饲养，实验开始后每天灌胃与实验组等比例的生理盐水，其余3组每天置于静式染毒柜内进行香烟暴露，根据相关文献（童寅等，2015），每天2次烟熏（12:00和18：00），第1天每次2支，每隔3d增加1次烟量（每次增加2支），最高增加至每次8支不再增加。从烟熏开始至结束共计33d，其中第8天、第15天不进行烟熏。具体方法：同时点燃单次用烟，燃烟开始时将小电风扇放置于距染毒柜一定距离，对准染毒柜底部小孔吹风至烟燃完（保证一定量的空气进入，防止烟熄或者小鼠窒息），关闭风扇，再熏10md。本研究所用静式染毒柜为桶状、半封闭的透明染毒柜，底部有一圆形小口（即毒物入口），上方盖子有一烟囱状气体出口。
从烟熏处理开始的第17天晚上21:30开始对小鼠进行灌胃直至烟熏结束，灌胃共计16d（中间1d不进行灌胃）。灌胃剂量参考隋世燕等（隋，2017）和（，2011）文，熏烟组使用生理盐水灌胃（10mL/kg体重）；低剂量组灌胃美洲大k醇提物（10mL/kg体重, 0.09g/mL）；高剂量组灌胃美洲大k醇提物（10mL/kg体重，0.27g/mL）。实验结束后，采集全血和肺脏。所有实验小鼠均自由采食、饮水，保持室温。
1.2主要试剂和仪器
1.2.1主要试剂
SOD、GSH-Px、CAT、MDA和NO检测试剂盒，均购自南京建成；TOzol购自Life TechnoWgds；含S
法拉利458YBR GREEN的DNA聚合酶、DNA酶，购自Takara；反转录酶购自Pomega;RNA酶抑制剂和dNTP，购自南京生兴。引物由苏州金唯智合成。1.2.2主要仪器
可见分光光度计；NanoDap分光光度计（ND-1000）；普通PCR仪；实时荧光定量PCR仪；荧光显微镜（BX41）。
1.3试验方法
1.3.1样本采
实验开始36d后采样，称量体重后摘眼球法取血，注入含肝素钠的2mL EP管；采集肺脏称重，每个肺脏剪取相同部位的部分肺组织放入4%多聚甲醛进行固定，剩余肺脏放入EP管中，置-80k冰箱保存。血液4000）/min离心10md，收集上清。肺脏病理切片由大理州人民医院病理科制作。肺脏系数即肺脏体重比，是肺脏与体重量的。
1.3.2血浆中各氧化和抗氧化应激指标测定
相关指标的测定按照商品说明书进行操作。1.3.3基因表达测定
1.3.3.1RNA提取及质量控制
使用TOzol提取肺脏组织总RNA，然后使用NanoDop测定其浓度，如果超过2000ng/»L则稀释后重测，使OD260脾80在2.0左右。最后取6! RNA，使用双蒸水稀释到500ng/piL，每管吸取4i L，各吸2管，用于RNA反转录。
1.3.3.2反转录
使用两步法进行反转录，反应总体积为25i L。反转录产物置4k冰箱备用。
1.3.3.3引物设计
驾照记分将迎大调整根据GenBank上小鼠的相关cDNA序列，使用CNKI网站中的POmer-PLAST设计目的和内参3 Actin因的引物，最由州唯智成（表1）'
1.3.3.4PCR扩增反应
将cDNA原液稀释10倍，使用实时荧光定量PCR仪进行检测目的基因的表达，使用20i L体系。PCR反应条件为：95k预变性5min；95k变性30s,64k退火20s,72k延伸20s，共35个循环。统计方法使用2"AA Ct法。
1.4数据统计与分析
所有实验数据均采用平均值土标准误表示，使用SPSS17.0中的One-Way ANOVA进行统计分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
3期王钦等：美洲大赚乙醇提取物对香烟引起小鼠肺脏氧化应激的干预效果研究
679
Table 1
表1基因表达引物序列
Primer sequences of the target genes
的因
Target gene
PCR 产物(bp )PCR pmducts
引物序列
Primer sequences (5r 一3，)
因序列
GenBank ID CAT
175F ： CACTGACGAGATGGCACACT
NM 009804sod
244
R ： TGTGGAGAATCGAACGGCAA F ： GAGAGCAGCGGTCGTGTAAA
NM 013671
GSH-P X
151
R ： AGCCTCGTGGTACTTCTCCT F ： GCAATCAGTTCGGACACCAGAATG
NM 001329527
p-Actin
218
R ： AGGAAGGTAAAGAGCGGGTGA F ： GCTTCTAGGCGGACTGTTACT
NM 007393
R ： GCCTTCACCGTTCCAGTTTTT
2结果与分析
2.1美洲大曝醇提物对熏烟小鼠肺脏系数和血液
中各指标的影响
2.1.1对血浆中S0D 和CAT 活力及肺脏系数的
影响
4个组对小鼠血浆中总S0D 和CAT 活力以及
小鼠肺脏系数的影响 之间均没有统计学意义
（P 〉0. 05 ）。
2.1.2 对血浆中NO 、MDA 含量和GSHY x 活力的
影响
剂量和高剂量 大 对照
，
对血浆中N0和MDA 的含量（图1-Y 和图1-L ）
以及GSHG x 的 （图1-L ）的影响 统计学
意义（P>0. 05 ）o 但是，与对照
，熏烟组
了血浆中N0的含量（P=0. 027）, J
降低了血浆中GSHG x 的活力（P=0. 028 ）；与熏
烟 ，低剂量组（P =0.041和P =0.025）和
郑民高速高剂量组（P =0.029和P=0. 028）均显著降低
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图1美洲大赚醇提物对熏烟小鼠血浆中NO 、MDA 和GSHG x 水平的影响
Fig. 1 EEeet of Perplxoetx xmePc/ox ethanol extract on the levet of N0( MDA and GSH-T X in plasmo of mice by cigarette smoke
注：“ * ” 表示 P < 0. 05 ，两组之间比较差异显著。Notes :“ * ” meant P < 0. 05 , dOfemd significontty between two
groups.
680环境昆虫学报 Jourert g Eeviroumeetot Entomology 43卷
了血浆中NO 和MDA 的含量； 剂量组则升高了血浆中GSH-L x 的活力（P=0. 029），分析
结果见图1。
2.2
提物对熏烟小鼠肺脏中各指标的
影响
2. 2.1对肺脏中SOD 及CAT 活力的影响
4个对小鼠肺脏中总SOD 和CAT 的影 响相互之间均没有统计学意义（P>0.05）。
2. 2. 2 对肺脏中NO 、MDA 含量和GSH 辛_活力的
影响
剂量和高剂量美洲大赚组与对照组相比，
对肺脏中NO 和MDA 的含量（图2-S 和图2-Z ）
以及GSH-L x 的活力（图2-Z ）的影响均没有统计
学意义（P>0. 05）。但是，与对照
，熏烟
组显著升高了肺脏中NO （ P 二0.036 ）和MDA （P =0.026）的含量。与熏烟组相比，低剂量组 （P 二 0.040 和 P 二 0.046）和高剂量组（P 二 0.037
和P 二0. 013） 了肺脏中NO 和MDA 的
含量；并且 剂量组（P = 0. 040）和高剂量组
（P=0. 036）
了肺脏中 GSH-L x 的
,
析结果见图2o
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图2美洲大赚醇提物对熏烟小鼠肺脏中NO 、MDA 和GSH-P x 水平的影响
Fig. 2 EElt of PeWplreetr rmericrer ethanof extract on the level of NO ( MDA and GSH-P X in lung of mice by cipantt o smoke
注：“ * ” 表示 P <0. 05 ，两组之间比较差异显著。Notes : “ * ” meant P <0. 05 , diffend sipniicantty between two groups.
2.3美洲大螞醇提物对熏烟小鼠肺脏组织结构的 影响对照组小鼠肺泡大小、分布基本均匀、结构 完整（图3-X ），气道壁结构 、
完整，纤
毛
（图4-X ）o 熏烟组肺泡 为 ，肺
宝马m1多少钱泡隔变厚、 裂，肺泡腔融合变大，
血现
象（图3-Z ） °与熏烟组相比，低剂量组肺泡分布
改善，肺泡隔断裂较少，但 正常对照组肺泡
融合扩大现 严重，肺泡隔 （图3-Z ）；
剂量组小鼠肺泡组织、结构明显改善，渗血
少，
正 常 对照 ， 但 肺 泡 融 现
（图 3-D ）
°
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