平肝止痫复方联合卡马西平对难治性癫痫大鼠海马
及颖叶皮质区MRP " 'P-gp 表达的影响*
*基金项目：国家自然科学地区基金项目(81760857)；贵州省科学技术基金项目(黔科合J —#2014]2042号)
第一作者简介：安运佳(1993 -)，女，在读硕士研究生，研究方向：中西医结合临床神经病学。
△通信作者：王强，E - mail : 1610690726@ qq. com
安运佳1，王 强】△，钱忆家1，薛 红2，李若照2，娄金波2，刘运权「2
(1•贵州中医药大学，贵州 贵阳550003 , 2.贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳550002 %摘要：目的 探讨平肝止痫复方联合卡马西平对难治性癫痫模型大鼠海马及颖叶皮质区多药耐药相关蛋 白1 ( MRP1)、P 糖蛋白(P-gp )表达的影响。方法 选择Wistae 大鼠，采用颅内注射海人酸建立难治性癫痫大
鼠模型，随机分为假手术组、模型组、卡马西平组(0. 03 g/ke )，平肝止痫复方组"4. 80 g/ke )，高、中、低剂量平肝
止痫复方+卡马西平组"9.60 +0.03 e/ke ,4.80 +0.03 e/ke ,2.40 +0.03 e/kg )。假手术组、模型组采用等体积 蒸馅水灌胃，各组连续给药4周，RT-PCR 检测海马及颖叶皮质区MRP ]、P-gp mRNA 的表达；Western Blot 检 测(WB 检测)海马及颖叶皮质区MRP 、P - gp 蛋白的表达。结果 与假手术组比较，模型组海马区及颖叶皮质 区的MRP]、P-gp mRNA 含量及蛋白的表达均明显升高(P <0.01 )；与模型组比较，平肝止痫复方联合卡马西 平用药均能显著降低海马区及颖叶皮质区MRP 、P-gp mRNA 含量及蛋白的表达(P <0.01 ,P<0. 05)；与卡马 西平组比较，平肝止痫复方联合卡马西平用药较好，其作用效果与给药剂量高低呈正相关。结论 平肝止痫复
方联合卡马西平能够显著降低难治性癫痫大鼠MRP 】、P - gp 表达水平，逆转和降低海马区MRP 、P - gp 蛋白的
表达可能是平肝止痫复方联合卡马西平抗耐药性癫痫作用机制之一。
关键词：平肝止痫复方；卡马西平；难治性癫痫大鼠；耐药性蛋白中图分类号:R285- 5
文献标志码:A 文章编号：1007 - 2349 (2021)04 - 0067 - 06
Effect of Pinggan Zhixian Compound Combined with Carbamazepine on the Expression of MRP O and P - gp in Hippocampus and Temporal Lobs Cortex of Refractory Epilepsy Rats
AN Yun -jia 1 , WANG Qian/1 , QIPN Yi-jia 1 , XUE Hong 2, LI Ruo - zhao 2, LOU Jin - bo 2, LIP Yunquan 1，2
(1. Guizhou University of Traditional Chinese Medicine , Guiyang 550003, China ,
2. The Second kffOiated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine , Guiyang 550002 , China )
【Abstract ] Objectiw : To Study the effect of Pinggan Zhixian Compound combined with carbamazepine on the ex
pression of multi - drug osistancc related protein 1 ( MRP 1 ) and P - glycoprotein ( P-gp ) in the hippocampus and imporal Abe cortex of ofractoo epilepsy model rats. Methods : Wistae rats were selected and intracranial injection of
kainic acid was used to establish a ofoctoTy epilepsy rat model. The rats were randomly divided into sham operation
goup , model goup , carbamazepine goup (0.03 e/kg ) , and Pinggan Zhixian Compound goup (4. 80 e/kg ) , high ,
medium , and low - dose Pinggan Zhi - epiepsy compound + carbamazepine goup ( 9. 60 +0. 03 g/kg , 4. 80 +0. 03 g/kg , 2.40 +0.03 e/kg ) . The sham operation goup and the model goup were given Plmaaastmc administration with
equal volume of distilled wteo Each goup was given continuous administration 't 4 weeks. RT - PCR was used to detect the expression of MRP 1 and P-gp mRNA in the hippocampus and temporal Abe cortex and Western Blot used
to detect the hippocampus and temporal Expression of MRP 1 and P-gp protein in temporal cortex. ResuAs : Compared
with those of the sham operation goup , the MRP 1 , P-gp mRNA content and protein expression in the hippocampus
and temporal Abe cortex of the model goup were signPicantly increased (P <0. 01) • Compared with those of the model
长安面包车的价格group,tha Pinggan Zhixian Compound combined with cyrbamazeppla goup couA significyntly oduco tha MRP[,P-gp mRNA content and protein expression P i tha hippocampus and temporal Aba coOea
areis(P<0.01,Pv0.05).Compared with tha cyrbamazepina goup,tIv Pinggan Zhixian Compound combined witli cyrbamxepina group had a bettae drug effect&and its effect was positively correlated witI tha level of administration dosa.Conclusion:Pinggs Zhixian Compound combined with00x11X1:110can significyntly oduco tIv expression levels of MRP[and P-gp C ofoctoo epilepse rats.Reversing and reducing tha expression of MRP[and P-gp protein in hippocampus mxy ba ona of tha mechanisms of anti一dog-resistant epilepse of tha combination of Pinggxn Zhixixn Compound and cerbamazepino.
【Key word】Pinggxn Zhixixn Compound;cerbamazepino；refractoro epilepse ots;dog resistance protein
癫痫是以脑神经元异常放电引起反复痫性发作为特征的一种慢性脑部疾病，全球癫痫患者高达6500万人，少部分患者进展成难治性癫痫［1'2］（临床上大约有三分之一的患者对抗癫痫药物（antiepileptic drug,AED）不敏感而使得癫痫发作不能得到有效控制，反复的癫痫发作导致神经元的坏死与凋亡、突触重塑，从而成为难治性癫痫（intractabla epilepsy, IE）#3"〕。目前，阐明难治性癫痫的发病机制，预防和降低癫痫发作一直是癫痫研究的热点。
卡马西平作为癫痫的经典药物&广泛的运用于临床及基础研究，课题组前期研究表明，平肝止痫复
方对难治性大鼠具有显著的效果［6-7］。在此基础上本次研究将探讨平肝止痫复方联合卡马西平及单用卡马西平对难治性癫痫大鼠的效果，观察中药复方是否显著增强疗效。本实验通过颅内注射海人酸建立难治性癫痫动物模型，探讨平肝止痫复方联合卡马西平对难治性癫痫模型大鼠海马区及h叶皮质区MRP1、P-gp表达的影响。为进一步从耐药性蛋白表达的角度探讨其作用机制奠定了一定的研究基础。
1材料与方法
起亚k5混合动力版1-1试验药物平肝止痫复方药物组成：天麻、石菖蒲、全蝎、郁金、胆南星，均购于贵阳中医二附院中药免煎颗粒冲剂配方，来自四川省绿药业科技发展股份有限公司。天麻，产品批号：1008072，每袋1.5g，相当于饮片3g；石菖蒲，产品批号：1009044，每袋1.1g，相当于饮片6g；全蝎，产品批号：1108023，每袋
0.6g，相当于饮片3g；郁金，产品批号：1009018海袋
1.5g，相当于饮片3g；胆南星，产品批号：1002036，每袋1.5g，相当于饮片3a；丙戊酸钠片（湖南湘中制药有限公司，批号：120402）；海人酸（美国Sigmx公司，货号:K0250），卡马西平（江苏恩华药业，生产批号: H321502）；兔单抗GAPDH"杭州贤至生物有限公司，批号:AB-P-R001）、兔单抗MRP1（Invitogen，批号：PA5-78694）、兔单抗P-gp（Abeam，批号：Ab170904）。
1-2动物健康Wistar大鼠100只，雄性。体重230-270g，从长沙市天勤技术有限公司购买，饲养于贵州中医药大学动物实验中心，生产许可证号: SCXK（湘）2014-0011。术前每组均以大鼠标准饲料喂养，自由饮水，适应性喂养至体重（250±20g）后进行实验研究，室温18~22U，湿度为60%-70%o
1-3试剂BCA蛋白浓度检测试剂盒（批号: C1090、P0011，上海碧云天生物公司）；TAKARA荧光定量试剂盒（批号:RR036Q、RR820A，宝生物工程（大连）有限公司）；蛋白MarkeO批号：DM131-02，北京全式金生物技术有限公司）；TREol试剂（批号:Lot: 252250AX，北京艾德莱生物科技有限公司）；RNA反转录试剂盒，兔单抗P-gp、兔多抗MRP1（批号: ab170904、pa5-78694,Abeam）。
1-4仪器水平电泳仪、紫外分析仪（型号：JY300、JY02S，北京君意东方电泳设备有限公司）；电转仪、垂直电泳槽（型号：DYCZ-40、DYCZ-24DN，北京六一仪器厂）；实时荧光定量PCR仪（型号：QuantStudio6,ABI）；PCR仪（型号：EDC-810，北京东胜创新生物科技有限公司）；离心机（型号：HI650，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；分光光度计（型号：752，舜宇恒平科学仪器有限公司（上海））；超级纯水仪（型号：AJY-0501,Aquapo）；电热恒温鼓风干燥箱（型号:DHG9203A，上海精宏实验设备有限公司）；电热恒温水浴锅（型号：HW-SY11-K P2，北京市长风仪器仪表有限公司）；酶标
仪（Thermo，型号：（+/SKANMK3）；移液器（规格：0.5+L,10+L,100+L,1000+L，大龙兴创实验仪器（北京）股份公司）。
1-5方法
1-5.1分组及给药将100只大鼠适应性饲养7d 后进行造模，采用Racine评分法进行分级评分：1级，咀嚼、眨眼、立须等面部肌肉的抽搐;II级，以点头运动为主的颈部肌肉抽搐；-级，单侧前肢阵挛、抽搐; .级，双侧前肢阵挛、抽搐伴身体立起;V级，双侧后肢强直，身体背曲强直，跌倒伴全身阵挛。造模后出现.级以上发视为癫痫造模成功，未达到.级发作的归入造模不成功组弃用。最终有48只大鼠造模成功，成功率为48%o将制备成功的难治性癫痫模型大鼠随机分为:①模型组,②卡马西平组,③平肝止痫复方组，④平肝止痫复方（高剂量）+卡马西平组，⑤平肝止痫复方（中剂量）+卡马西平组，⑥平肝止痫复方（低剂量）+卡马西平组，每组8只，另设假手术组8只。模型组与假手术组常规饲养，给予生理盐水2mL/d灌胃，每天早上9点给药，剩余各组每天一次给予药物干预。按照实验动物学人与大鼠用药剂量换算方法进行转换：卡马西平用量为0.03g/（kg-d），每天1次；平肝止痫复方组用量分别取免煎颗粒各成分的中剂量相加为4-80g/（kg-d），以此类推平肝止痫复方组高、中、低剂量为9.60g/（kg-d）, 4.80g/（kg•d）,2.40g/（kg-d）；平肝止痫复方（高、中、低剂量）+卡马西平组用量为：9.60+ 0.03g/（kg•d）,4.80+0.03g/（kg•d）,2.40+ 0.03g/（kg•d），每天1次。各组大鼠统一灌胃给药，连续灌胃给药4周后分别取材（
1-5.2难治性癫痫大鼠模型制备10%水合氯醛4mL/kg腹腔注射WPtar大鼠，麻醉后，将其头部置于颅脑立体定位仪上，剃毛备皮,75%酒精消毒，沿矢状线剪开约2cm皮肤，暴露颅骨，在头部背侧中部作纵
行切口，依次切开皮肤、皮下组织，钝性分离骨筋膜拉钩暴露手术视野，按大鼠脑立体定位图谱，选择右侧海马腹后部CA3区的三维坐标:X=-5.3mm,Y= 4-0mm,Z=-6.0mm，即注药点，调整X轴和Y轴的坐标确定H点（X=-5.3mm,Y=4.0mm, Z=0.0mm）并在H点颅骨钻孔，在微量注射内抽入1+//+L的海人酸2+L，向下进针-6.0mm达CA3中心点，在10min内缓慢匀速地注射完毕，留置5->10mm后缓慢拔出注射器后钟表螺丝封口，在对应左侧上钟表螺丝，用牙科水泥封口，将电极接在钟表螺丝上面，缝合头皮。假手术组在同样解剖定位下予2+L生理盐水。
1.5.3难治性癫痫大鼠造模成功标准结合近年来的相关文献研究，海人酸癫痫大鼠模型的成功标准判定为：人区注射后，大鼠癫痫发作，若4h内连续出现3次IA-V级发作，同时在慢性期内观察出现自发性痫性发作的大鼠作为制作成功的难治性癫痫大鼠模型［8］。本实验结合以上判断标准及前期课题组研究情况进一步完善后制定难治性癫痫模型成功标准为：（1）KA海马CA3区注射后Racine分级出现IA级以上癫痫持续状态时间（> 30min）°（2）在经过苯妥英钠药物筛选后的慢性自发发作期内出现自发性痫性发作超过3次Racine分级达III级以上发作。（3）脑电图监测显示有明显癫痫波3次以上者，作为难治性癫痫成功的标志。（4）自发发作期痫自发发作的脑
过程未出现明显癫痫波的大鼠予弃用。
1.5.4脑组织标本制作将WPtar大鼠快速处死，置于冰盘上，开颅迅速取出脑组织，将大鼠脑干及小脑
切除，小心沿矢状面切开脑半球，剥离注射侧，将海马与颛叶皮质区分别装入EP管中，做好标记，采用4%多聚甲醛进行固定，并放入-80U低温冰箱保存备用。脑组织标本常规脱水及石蜡包埋操作，相关染步骤按照检测试剂盒说明书记录进行染操作（
起亚k5新款1.5.5QPCR法检测大鼠海马组织及海马神经元细胞中MRP1、P_gp的mRNA表达设计并合成大鼠MRP1、P-gp及GAPDH基因的QPCR检测引物（表1）（首先严格按照TRAol试剂盒说明书要求，分别取海马组织提取总RNA（其次，按照逆转录试剂盒操作要求，把RNA逆转录成cDNA（QPCR的总反应体系为20+L，其中包含了实时PCR预混液10+L，左、右引物各0.8+L，超纯水7.4+L以及模板1.0+L（然后QPCR分三步进行：30s95U预变性，5s95U变性,20s60U退火及20s72U延伸，共进行40个循环，每个样品均检测3次（最后采用2-""Ci法分析目的基因的相对表达情况（
表1引物序列表
Name
POmer Sequence
Size
Forward
5 4 - ACAGCAACAGGGTGGTGGAC - 3'Rat GAPDH
Reverse
5' - TTTGAGGGTGCAGCGAACTT - 3'253bp
Foovard
5' - TTGACTCGGGAGCAGAAGTT - 3'Ratp - gp
Reverse
5' - AACCGGAAACAAGCAGCAT -3'
150bp
Foovard
5' - GAAACGGAGAAGGAGGCTT -3'Rat MRP 1
Reverse
5' - ACGACCCACAATACCAACCT - 3'
181bp
1.5.6 WB 检测大鼠海马区及颖叶皮质区MRP 】、
P-gp 的变化 取出冻存的海马及颖叶皮质组织，加
入蛋白裂解溶液600 +L ，于冰上裂解15 min ，于4 °C
下离心10 min ，转速为12000 r/min ，收集上清液。于
4O C 下经一抗MRP 】
'P-gp 、内参GAPDH 等过夜静置
孵育，在37O 条件下，通过标记二抗辣根过氧化酶摇 床孵育2 h 后，进行ECL 化学发光增强显影后扫描胶
片，将成像所得图片Imgc J 图像分析软件灰度分析,
以GAPDH 为内参，对目的蛋白、内参蛋白条带光密度 值进行统计分析，目的蛋白的表达量以两者光密度比
值（目的蛋白/内参蛋白）表示。
1.5.7统计学方法 将本实验数据录入EXCEL 建
立数据库，使用SPSS 20.0进行统计分析，计量数据
以平均值土标准差（J ±i 来表达，满足正态分布与差
齐性检验的数据，多组间比较使用单因素方差分析
（One-way ANOVA ），2组间比较用LSD - i 检验，对不
海马汽车标志满足方差齐性者采用Kruskal - Wallis " K- W ）检验。
2结果
2. 1 MRP 1 'P-gp 及 GAPDH mRNA 的 RT PCR 表达
结果 各实验组大鼠海马及颖叶皮质区中MRP1及 P-gp mRNA 表达情况如表2、图1所示。与假手术 组比较，模型组大鼠海马及颖叶皮质区MRP 及P -
/表达均有显著性增加（PV0.01 ）。与模型组比较, 各给药组大鼠海马及颖叶皮质区MRP 表达均有显
著性降低（P <0.01），除单纯中药复方组以外，卡马
西平组、不同剂量平肝止痫复方联合卡马西平组大鼠 海马及颖叶皮质区P-gp 表达均显著性降低 （P<0. 05），表明药物干预后，能逆转下调在海马区
及颖叶皮质区MRP1及P - gp 表达水平；与卡马西平 组比较，不同剂量平肝止痫复方+卡马西平组能显著
降低MRP 的表达（P<0. 05），但P-gp 的表达无明 显差异。见表2、图1。
表2各实验组大鼠海马及裁叶皮质区MRP "及P-gp mRNA 的表达（J 土pn 二8）
组别剂量"g 试g ）MRP 1 mRNA P-gpmRNA 术组0. 89 ±0. 22
1. 17 ±0. 32型组
3. 12 ±0.60 **
2. 81 ±1. 18西
0.03
2. 29 ±0. 13 **** 1.86 ±0.21、
平肝止痫复方 4.80 2. 08 ±0. 22 ****
2.00 ±0.31痫复方 + 西9.60 +0.03 1.40±0. 26**△△
1.32±0. 43"痫复方 + 西 4. 80+0. 03
1.51 ±0. 13 ***△ 1.59 ±0. 16、
世界豪车排名痫复方 +
西
2.40 +0.03
1.98 ±0. 39 ***
1.70 ±0. 42"
注：与卡马西平组比较，不同剂量平肝止痛复方+卡马西平组能显著降低MRR1的表达（P <0. 05）
■ MRP1 ■ P-gp
图1各试验组大鼠海马及裁叶皮质区MRP "及P-gp mRNA 的表达
注：与模型对照组比较,* P<0. 05 ,** P<0.01 ；与假手术组比较,* P<0. 05 ,** P<0.01 ；与卡马西平组比较,"P<0. 05,""touareg
P<0.01
2.2脑组织MRP】及P-gp Western Blot检测大鼠海马及颖叶皮质区的MRP1及P-gp蛋白表达见图4，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中MRP1及P-gp蛋白表达极显著增强（P<0.01），与模型组比较，平肝止痫复方低、中、高剂量联合卡马西平组大鼠脑组织MRP1及P-gP蛋白表达显著减才、（PV0.05）。见图2O
图2各试验组大鼠脑组织中海马区及裁叶皮质区MRP"及P-gp蛋白的表达A：假手术组；B：模型组；C：CBZ组;D：平肝止痫复方组；E：平肝止痫复方（低）+CBZ组;F：平肝止痫复方（中）+CBZ组;G：平肝止痫复方（高）+CBZ组
注：与模型对照组比较,*P<0.05&※※P<0.01；与假手术组比较,*P<0.05,**P<0.01
3讨论
癫痫是一种病因十分复杂的神经系统疾病，癫痫发作是大脑异常过度神经元放电的结果，近年来，癫痫的耐药机制成为研究的重点，研究发现，多药耐药相关蛋白，如MRP】、P-gp等表达上调与难治性癫痫耐药性的产生密切相关#9-10$，故通过本试验的研究，为进一步从多药耐药相关蛋白的表达探讨其作用机制提供一定的实验依据。近年来，难治性癫痫的耐药机制成为研究的突破，研究发现，耐药
性蛋白MRP、P-gp表达治癫痫耐药的密切关”⑴o P-gp和MRP1是两种具有“药物泵”功能的蛋白，两者均能主动把疏水化合物和药物从细胞内转运到细胞外。目前发现大多数抗癫痫药物具有很好的脂溶性，能够通过被动扩散透过血脑屏障,MRP1和P-gp是它们的底物，但若脑内多药耐药蛋白表达增高，抗癫痫药物在透过血脑屏障（BBB）时可被P-gp MRP1泵中，药进脑，使抗癫痫药物浓度降低#12$。难治性癫痫患者中，因为P-gp和MRP】等蛋白在脑组织的过量表达，参与了多种抗癫痫药物的转运，降低了脑组织内的血药浓度，导致癫痫反复发作，成为难治性癫痫患者。
癫痫的原则是基于该病的发病方式及不同的症状体征来选择药物。临床颖叶癫痫发作类型类似于在海马区局部注射海人酸引起的SE后慢性特发性癫痫模型，表现为癫痫综合征和复杂部分性癫痫发作。卡马西是复杂部分性癫痫发作在临床用药中的首选，故本实验阳性对照药物选用卡马西平O 卡马西平系广谱抗癫痫药物，主要作用于中枢神经系统，特别适用于癫痫复杂部分彳发作、亦称精神运动性发作或颖叶癫痫，对大发作、局限性发作、和混合型癫痫也有效。实验药理发现卡马西平无论是对全身性的癫痫模型还是对部分性的癫痫模型都具有良好的抗惊厥效果。卡马西平的主要作用机制可能与降低神经细胞膜对Co2+和No+的渗透性，以此减轻细胞的兴奋性，延长神经细胞的不应期有关。同时也与增加，-氨基丁酸的浓度，促进GABA突触之间的传递°卡马西平在临床应用中有诸多不良反应，如肝功能损害、皮疹、造血功能受损、共济失调等，严重的副作用是剥脱性皮炎。本实验研究中观察到卡马西平的大鼠未发现明显皮疹及共济失调，但本实验未检测肝功能及造血系统的变化。
癫痫属于中医痫证的范畴，早在两千多年前，中医就已经认识到癫痫与肝风内动密切相关，如
*素
问・风论篇》：“风者，善行而数变”。另有“善行者，无处不到，数变者，证不一端。风之为邪气，其厉矣哉”、“风通气于肝，肝主筋，故风伤筋”的理论。中医学认为癫痫是一种发作性的神志异常性疾病，其病机为肝风内动，风痰上扰，心神被蒙；肝火素旺，火动生风，煎熬津液，结而为痰，风动痰升，阻塞心窍。主要病理乃风、痰、气、火、瘀，胶结不解，其病变脏腑虽为心、肝、脾、肾，但总离不开肝主疏泄、藏血功能失常；心主藏神，肝血充盈，则心有所藏，肝血不足，则心脉
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