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摘 要：酚抽法已经逐渐成为植物蛋白质组研究中通用的蛋白质提取方法，但在各种改进酚抽法中，应用到的沉淀试剂各不相同，致使蛋白沉淀得率、纯度和沉淀时间也各异，本研究以热带植物橡胶树叶片、胶乳和海马齿叶片为研究材料，在过饱和硫酸铵甲醇溶液、醋酸氨甲醇溶液和丙酮溶液沉淀剂下对比蛋白提取的效果，通过单向电泳检测、胶图质量分析、质谱鉴定、蛋白沉淀时间和得率比较，发现3种沉淀剂提取的蛋白样品1-DE图谱显示的蛋白条带数量均较多，但醋酸铵沉淀法提取蛋白图谱有条纹不清晰现象。得出结论：丙酮沉淀法对橡胶树叶片和胶乳蛋白质的提取率较高，硫酸铵沉淀法对海马齿叶片蛋白质提取率较高。过饱和硫酸铵甲醇溶液和丙酮沉淀剂提取的蛋白质质量较高，所得蛋白图谱背景清晰，质谱鉴定蛋白质信息量大。研究结果可优化提取高质量植物蛋白质的方法，并有望为顽拗类植物蛋白质组学研究提供参考。
v12 vantage速腾2014款 关键词：蛋白提取;橡胶树;海马齿;沉淀剂;聚丙烯凝胶电泳;质谱
中图分类号：TQ936 文献标识码：A
Comparative Analysis of the Effects of Different Precipitation Agents on Extraction of Plant Protein by Phenol Extract
HUO Yuxin1， GAN Panlu1， WANG Yujing1， ZHANG Xueyan1， WANG Xuchu1，2*， XIE Quanliang1，2*
1. Hainan Normal University / Key Laboratory of Tropical Island Ecology， Ministry of Education， College of Life Sciences， Haikou， Hainan 571158， China; 2. College of Life Science and Agricultural， Shihezi University， Shihezi， Xinjiang 832003， China
Abstract： The borax/PVPP/phenol （BPP） protocol is a widespread protein extraction method in plant proteome research. However， BPP extraction of plant protein， combined with different precipitation agents， the precipitation time， yield and purity of extracted protein is strikingly different. In this study， Sesuvium portulacastrum and Para-rubber tree leaves， and rubber latex were used as the research materials. The plant protein was extracted and analyzed with precipitating agents of supersaturated potassium ammonium sulfate alcohol solution， ammonium acetate methanol solution and acetone solution. Using the methods of SDS-PAGE， gel electrophoresis image quali
ty， mass spectrum identification， settling duration and comparative analysis of protein yield， it was showed that the protein bands extracted by the ammonium acetate precipitation method were not evident. Hevea leaves and latex showed a higher yield of protein in acetone solution. S. portulacastrum leaves had a higher yield of protein in supersaturated potassium ammonium sulfate alcohol solution. The clear background of gel electrophoresis figures was found for the supersaturated potassium ammonium sulfate ethanol solution and acetone solution. The comprehensive protein sequence information identified by mass spectrometry had a higher quality of precipitated protein. The research results can optimize the method of extracting high-quality plant protein， and it will be expected to provide references for recalcitrant plant taxa proteomics research in the future.
Keywords： protein extraction; Hevea brasiliensis; Sesuvium portulacastrum; precipitant; polypropylene gel electrophoresis; mass spectrometry新款跑车
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.035
從植物组织中制备高质量的蛋白质样品用于蛋白质组学分析是一个巨大的挑战，而蛋白质组学已经发展成为研究植物蛋白功能的重要技术手段[1-2]，是一种检测植物基因在转录后是否被翻译和修饰等较新颖且有效的研究植物蛋白的方法，从而填补了从转录组到代谢组的中间空缺[3-5]。目前，蛋白组学的研究技术方法有很多，例如2-DE[6]、MALDI[7]、Label-free[8]和iTRAQ/TMT[9]等技术，被广泛用于研究某种特定生理环境下动植物的全蛋白、差异表达水平以及互作分析等。但由于植物各种组织细胞中含有特定的物质能够降低提取蛋白的质量及产率，所以无法提取固定得率的蛋白质，需要针对特定的材料采取特定的提取处理方法[10-11]，从而提高提取植物蛋白质的质量，这也是决定蛋白质组学后续比较分析的关键因素。
由于植物组织的特殊特性，通常因坚固的细胞壁、蛋白酶、大的液泡、高浓度的有机酸和次级代谢产物（酚类化合物和素）等物质，严重干扰蛋白质的提取、分离和鉴定，致使从植物各组织中分离蛋白质组分具有很大的挑战性，也是影响植物蛋白组学研究最关键因素[12-14]。利用酚抽法可用于顽拗类植物组织中蛋白质提取[15]，但提取蛋白的得率还需进一步提升。针对木本植物橡树、松树和杨树的次生木质部总蛋白提取，发现使用优化的TCA-丙酮方法，提取蛋白质效果最佳[16]。在挪威针云杉和欧洲山毛榉的叶和根中分
离蛋白质，发现在包含7 mol/L尿素和2 mol/L硫脲的分离液剂下提取和分离蛋白质最佳[17]，但提取方法中并未涉及沉淀剂的深入讨论。在谷物种子中用不同缓冲液可以分离出种子内不同蛋白质用于蛋白质组学研究[18]，其在沉淀剂选择上并未改进。以三、丙酮沉淀和苯酚提取黄连木的雄性和雌性植物蛋白质比较研究，详细描述了这3种提取方法的优缺点和应用，使研究者能为特定的物种、组织或细胞类型选择合适的方法[19]，但是在沉淀剂的选择方面也未深入研究。在模式植物拟南芥中提取总蛋白时，可用常规溶解剂就能溶解一系列蛋白质，并实现其高效定量的回收，使用这种方法可用于试剂盒直接定量[20]，但并非绿植物都可以使用该方法。随后，Flengsrud[21]在大麦叶、马铃薯叶和云杉针叶组织中提取蛋白质，克服了绿植物中固有的蛋白质组学分析障碍，但在蛋白质的产率和纯化方面还有待优化。综上所述，在植物蛋白提取方法不断更新过程中，蛋白得率和质量是影响蛋白组学深入研究的主要因素，针对这方面的困难应着眼于在提取不同植物组织蛋白质过程中，如何选取最佳沉淀剂，从而获得纯度较高的蛋白质。
在笔者前期的研究中，发现利用本实验室改进酚抽法（Borax/PVPP/Phenol，BPP）提取橡胶树以及海马齿组织蛋白的得率以及质谱鉴定结果相差都非常大，难以进行后续蛋白质组学分析研究。因此，为了克服上述困难，我们选择了巴西橡胶树（Hevea brasiliensi
s）的叶片和胶乳（含多糖多酚类物质）以及高含盐海岸植物海马齿（Sesuvium portulacastrum L.）的叶片材料特殊性，提供了一种辅助蛋白质提取方法，首次针对这3种材料在BPP提取缓冲液结合过饱和硫酸铵甲醇溶液、醋酸铵溶液和丙酮溶液3种沉淀剂展开了蛋白提取方法的研究，在蛋白得率、凝胶图谱和质谱鉴定等方面系统分析。通过实验表明，针对不同植物材料选择不同沉淀剂的方法，确实对植物蛋白质提取很有效，并且同时适用于聚丙烯凝胶电泳及质谱分析的2种蛋白组学分析手段。为采用BPP法提取不同植物蛋白时选择合适的沉淀剂提供理论支持，也为今后植物蛋白质组学研究提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料
以中国热带农业科学院实验田内橡胶树（‘热研73-3-97’）新鲜叶片（Hevea leaves，HL）、橡胶树新鲜胶乳（latex，LA）以及番杏科多年生匍匐草本植物海马齿新鲜叶片（Sesuvium leaves，SL）为实验材料。橡胶树切割先让胶乳流25滴以上，流尽树皮表面的杂质后开始取样，取样用的割刀需要高温灼烧消毒灭菌后使用，以免引起H. brasiliensis死皮病。用植物蛋白质BPP法（Borax/PVPP/Phenol）提取蛋白。BPP蛋白提取缓冲液配车辆保险公司排名
置：100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris， 50 mmol/L维生素C，50 mmol/L硼砂，1%（V/V）Triton X-100，1 g（W/V）PVPP，30%（W/V）蔗糖和2%（V/V）β-巯基乙醇，pH 8.0;蛋白裂解液：1%（V/V）IPG buffer，2 mol/L硫脲，2%（W/V）CHAPS，7 mol/L尿素，13 mmol/L DTT;标准Laemmli buffer：0.001%（W/V）溴酚蓝，2%（W/V）SDS，5%（V/V）β-巯基乙醇，10%甘油，62.5 mmol/L Tris-HCl;胶条平衡液：0.002%（W/V）溴酚蓝，2%（W/V）SDS，30%（V/V）甘油，50 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L尿素;GAP凝胶染液：0.125%（W/V）考马斯亮蓝G-250，5%（V/V）磷酸，10% （W/V）硫酸铵，10%（V/V）甲醇，30%（V/V）乙醇;凝胶脱液：5%（V/V）乙酸，30%（V/V）乙醇;胰蛋白酶缓冲液;25 mmol/L碳酸氢铵，1 mmol/L氯化钙，pH 8.5。
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