盛佳钰;陈红风
【摘 要】Objective To establish a cisplatin-resistant 4T1 mouse model of triple negative breast cancer .Meth-ods A drug resistant mice model was established with cisplatin ( DDP ) induction and in-vivo/in-vitro tumorigenic ap-proach.Its resistance characteristics were identified by MTT assay .Changes of drug resistance gene ( MDR1, BCRP, MMP7, GST-π) and protein ( P-gp, BCRP, MMP7) expression, and phosphorate-Akt and total-Akt protein expression were evaluated by real-time PCR, immunohistochemistry and western blot method , respectively.Small animal live imaging technology was applied to detect tumor growth .Results Resistance fold (RF) of cisplatin-resistant 4T1 mouse model was 12.84.The expression of MDR1, BCRP, MMP 7, GST-πmRNA and P-gp, BCRP, MMP 7 proteins in the resistant mice were higher than that in the non-resistant mice .The result of western blot showed that a statistically higher expression of p-Akt in resistant mice than that in non-resistant mice at protein levels (P<0.01).No significant difference of tumor growth rate was
observed between non-resistant and resistant mice ( P>0.05 ) .Given same dose of DDP , resistant mice showed lower sensitivity than non-resistant mice significantly (P<0.01).Conclusions We have successfully established a cis-platin-resistant triple negative breast cancer model in mice , which provides a new platform for further study on chemoresis-tant reversal strategy and individualized clinical treatment of this disease .%目的 建立一种耐药性稳定的三阴性乳腺癌4 T1耐药小鼠模型,为研究体内肿瘤耐药机制和逆转药物的筛选奠定实验基础. 方法 采用顺铂( DDP)低剂量诱导及体内外交叉致瘤结合的方法建立三阴性乳腺癌耐药小鼠模型;MTT法检测细胞耐药特性;实时荧光定量PCR法分析耐药相关基因MDR1、BCRP、MMP7及 GST-π表达差异;免疫组化分析耐药相关蛋白P-gp、BCRP、MMP7表达差异;蛋白印迹法检测磷酸化Akt(phosphorate-Akt, p-Akt)和总Akt( total-Akt,t-Akt)蛋白表达;小动物成像检测观察肿瘤生长情况. 结果 MTT显示建立的三阴性乳腺癌耐药4T1小鼠模型的耐药指数为12.84;耐药小鼠肿瘤组织中MDR1、BCRP、MMP7、GST-π基因mRNA 的表达量及P-gp、BCRP、MMP7蛋白的表达量均高于非耐药小鼠(P<0.01);Western blot显示,耐药小鼠肿瘤组织的p-Akt蛋白表达明显高于非耐药小鼠,t-Akt蛋白表达没有差异. 非耐药小鼠与耐药小鼠肿瘤组织生长速度未见明显区别(P>0.05). 分别
给予这两种模型小鼠相同剂量的DDP后,耐药小鼠对DDP的敏感性明显低于非耐药小鼠(P<0.01). 结论 初步建立了三阴性乳腺癌耐药4T1小鼠模型,为三阴性乳腺癌临床个体化及耐药逆转研究等提供了良好的实验动物平台.
【期刊名称】《中国实验动物学报》
红旗h5小q【年(卷),期】2015(023)005
【总页数】8页(P466-473)
【关键词】三阴性乳腺癌;肿瘤抗药性;顺铂;动物模型;小鼠
4008【作 者】朗逸车座套盛佳钰;陈红风
【作者单位】上海中医药大学附属龙华医院乳腺科,上海 200032;上海中医药大学附属龙华医院乳腺科,上海 200032
【正文语种】中 文
【中图分类】Q95-33
绿驹电动车目前认为乳腺癌是一种高度异质性肿瘤，不同的病理特点和分子特征导致其对的反应和预后明显不同。临床上根据免疫组化检测的雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）表达均阴性者被称为三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）。该亚型乳腺癌对内分泌及抗HER-2的靶向均不敏感，因此化疗是其主要的手段。近年来研究发现，TNBC这类与乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene-1，BRCA1）相关的乳腺癌亚型对铂类药物表现出较高的敏感性［1］。然而，事实证明对化疗相对敏感的TNBC患者并不意味着拥有更高的生存率。与其他化疗药物一样，在临床应用过程中多数患者经铂类药物化疗缓解后，即会产生耐药性而使后续效果受到严重影响。本实验以顺铂（cisplatin，DDP）为诱导药物，三阴性乳腺癌细胞株4T1为诱导对象，采用化疗药物诱导耐药及体内外交叉致瘤的方式建立三阴性乳腺癌耐药小鼠模型，并对三阴性乳腺癌4T1耐药小鼠模型产生顺铂耐药性的机制进行初步探讨，为耐药逆转研究提供实验依据。
1.1 材料及试剂
注射用顺铂（冻干粉）购自齐鲁制药有限公司（批号：ZWA2A1305034A），RPMI-1640液体培养液、胎牛血清、胰酶、磷酸盐缓冲液（PBS）均为Gibco公司产品；四甲基氮唑蓝（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）及DMSO均购自上海生工生物有限公司。TRIZOL提取试剂盒、反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；实时荧光定量PCR所用引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成；抗磷酸化 Akt（phosphorate-Akt，p-Akt）、总 Akt（total-Akt，t-Akt）、内参GAPDH（均为抗兔单克隆抗体）及其相应的二抗均购自美国Cell Signaling公司；P-gp、BCRP、MMP7抗体均购自美国ABCAM公司；EliVision plus试剂盒、DAB试剂盒均购自福州迈新生物科技有限公司，D-luciferin购自上海乐辰生物科技有限公司。
1.2 细胞培养及动物饲养
鼠三阴性乳腺癌细胞株4T1购自中国科学院上海细胞库，用含10%胎牛血清的RMPI-1640培养基培养，培养基中加入100 U/L青霉素和10 mg/mL链霉素。置于37℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱中培养，次日观察细胞贴壁情况并换液。贴壁生长良好的乳腺癌细胞经0.25%胰蛋白酶消化，选用对数生长期细胞进行实验。
SPF级BALB/c雌性小鼠56只，体重16～18 g，其中24只小鼠用于耐药动物模型的建立（每轮6只，共4轮），余32只小鼠用于后续分组研究。小鼠均来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司［SCXK（沪）2012-0002］，适应性喂养1周，饲养在恒温（23±2）℃，湿度50%～60%，人工光照明暗各12 h的饲养室内，标准饲料和自来水自行取用。
1.3 模型的建立
采用化疗药物诱导耐药及体内外交叉致瘤的方式建立三阴性乳腺癌耐药小鼠模型。将4T1细胞体外培养至对数生长期后按105个/只，接种于6只小鼠的第二乳房垫处，随机均分为2组。待肿瘤组织长至0.5 cm×0.5 cm时（约5 d），模型组（3只）荷瘤小鼠给予腹腔注射0.3 mg/mL DDP，对照组（3只）小鼠给予同等剂量的NS腹腔注射。每周1次，连续4周，给药结束后，在无菌条件下取出各组肿瘤组织，行原代细胞培养。将组织块置于培养皿内，剪碎成米粒样大小，用胰酶反复消化瘤块，将消化下来的肿瘤细胞，按4T1细胞培养条件进行培养。各组原代培养细胞经稳定传代2次后，再接种于小鼠第二乳房垫，每次原代培养细胞均用采用MTT的方法计算耐药倍数。反复4轮体内外交叉致瘤，至耐药倍数达到中度耐药时（耐药倍数5～15倍）为止。最后一轮小鼠给药结束后，2组小鼠各取部分肿瘤
组织置于4%多聚甲醛溶液及ˉ80℃冰箱保存用于免疫组化、real-time PCR及western blot检测；剩余肿瘤组织分别行原代细胞培养。
奥迪二手车赶集取上述第4轮达中度耐药的原代培养4T1/ DDP细胞，培养至对数生长期，接种于6孔板中，继续培养24 h，当细胞达到70%～80%融合时，进行转染。转染按照Lipofectamine TM 2000试剂操作指南进行操作。转染48 h后，G418筛选抗性细胞及其单克隆化，得到稳定表达荧光素酶的4T1/DDP-luc细胞。取对数生长期的4T1/DDP-luc细胞接种到96孔黑板中，常规培养24 h。第2天采用活体成像仪进行luc发光信号的观察，检测luc的表达，用Living Imaging软件分析处理数据。
取32只小鼠，将上述经鉴定能稳定表达Luc质粒的耐药细胞株4T1/DDP-luc及非耐药细胞株4T1-luc体外培养至对数生长期后，按105个/只，分别接种于4组小鼠的第二乳房垫处，分别建立三阴性乳腺癌耐药及非耐药小鼠模型各16只。待各小鼠肿瘤组织均长至0.5 cm×0.5 cm时（约5 d），16只三阴性乳腺癌小鼠模型随机分组为：Model-A组及DDP-A组，每组各8只小鼠；16只三阴性乳腺癌耐药小鼠模型随机分组为：Model-B组、DDP-B组，每组各8只小鼠。各组小鼠均按0.2 mL/20 g剂量腹腔注射相应药物，给药频次为，给药周期为4周，
具体给药为：DDP-A及DDP-B组小鼠给予0.3 mg/mL DDP；模型组-A及模型组-B组小鼠给予0.9%生理盐水。
1.4 M TT法检测细胞药物敏感
分别取对数生长期原代培养4T1细胞（Control组）和4批原代培养的4T1/DDP细胞（Model-1、2、3、4组），调整细胞密度为5×104个/mL，接种于96孔培养板中，每孔100μL。置37℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱中培养。培养24 h后，加药组更换为含不同浓度药物的完全培养液继续培养。每组都设6个复孔，并设置调零孔（只含相应培养液，无细胞）和对照孔（只含细胞、培养液）。待药物组作用24 h后，每孔加入MTT（5 mg/mL）15μL，继续培养4 h，小心吸弃培养液和MTT溶液，每孔加入DMSO 150μL，振荡10 min使充分溶解显。用全波长酶标仪测定吸光度值（A490），实验重复3次，取平均值，按下式计算细胞生长抑制率。
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