卡泊三醇诱导小鼠特应性皮炎模型的最适条件探索
王璨;王晓钰;于曦;陶羽;王燕;包凯帆;季律;洪敏
【摘 要】Aim To investigate the method of establishing the atopic dermatitis mice model induced by calcipotriol ( MC903 ) . Methods Induction dose exploratory experiment: since d 0, 0.33,1,3 nmol MC903 was smeared on the right ear of BALB/c mice in each dose group respectively , for 7 consecutive days . The ear swelling degree of the mice was observed every day and the bilateral ears thicknesses were measured .The materials were drawn and analyzed in d 3 and d 7.Induction days exploratory experiment: 2 nmol MC903 was smeared on the right ear of BALB/c mice, for 14 consecutive days .The ear swelling degree of mice was observed every day and the bilateral ears thicknesses were measured .The histopathological examination of the right ear was conducted in 3 d, 7 d, 11 d and 15 d respectively .The tissue homogenate of the mice right ear was prepared .The ex-pressions of thymic stromal lymphopoietin (TSLP),IL-33, IL-4 and IFN-γin the homogenate , CD40 +,CD86 +,the DC surface markers and ILC2 contents in the peripheral lymph nodes were d
etected.Results ①1,3 nmol MC903 induced ear swelling in mice was significantly increased in d 3, the levels of TSLP and IL-4 were significantly increased .The level of IL-33 in 3 nmol dose group was increased significantly in d 7.② The right ear swelling of 2 nmol MC903 induced atopic dermatitis mice was significant , the ear thickness was increased gradually and reached the peak in d 14.The histopathological examination of the mice ear tissue showed in d 7, the right ear tissue of the mice was swelling and red , the capillary vessels were dilated and the infiltration of inflammatory cells was obvious .The ear in-flammatory symptoms maintained and gradually aggravated for 15 days.Compared with the normal mice , MC903 increased the TSLP level in the right ear tissue homogenate significantly in d 3 and then decreased gradually .The levels of IL-4 and IL-33 were increased significantly in d 7 and then decreased gradually .The levels of ILC2, CD40 +, CD86 + in the peripheral lymph nodes were increased in d 7 and d 15.Conclusion The atopic derma-titis mice model can be successfully established using 2 nmol MC903 induced mice for 7 days.Appropriate testing point of TSLP is d 3.Appropriate testing point of IL-33 and IL-4 is d 7.%目的探讨卡泊三醇（ MC903）致小鼠特应性皮炎模
型的建立方法。方法诱导剂量探索实验：从d0起，于各剂量组BALB／c小鼠右耳分别涂布0.33、1、3 nmol MC903，连续诱导7d。每天观察小鼠耳肿胀程度并测量双耳耳厚，分别于d3、7取材分析。诱导时间探索实验：从 d 0起，于BALB／c小鼠右耳涂布2 nmol· ear－1 MC903，连续诱导至d 14。每天观察小鼠耳肿胀程度并测量双耳厚，分别于d 3、7、11、15获取小鼠右耳组织进行病理组织学检查。制备小鼠右耳耳组织匀浆，检测匀浆中胸腺基质淋巴细胞生成素（ TSLP）、IL-33、IL-4、IFN-γ表达水平以及外淋巴结中DC细胞表面标记分子CD40＋、CD86＋和ILC2细胞百分含量的变化。结果①每耳1、3 nmol MC903诱导的小鼠耳肿胀度从d 3开始显著增加， TSLP、IL-4水平明显增加，每耳3 nmol MC903剂量组IL-33水平于d 7明显增加。②每耳2 nmol MC903诱导的特应性皮炎小鼠从d 3起，小鼠右耳耳肿胀明显，耳厚逐渐增加，并于d 14达到峰值；小鼠耳组织病理组织学检查显示，从d7起，小鼠右耳耳组织红肿，毛细血管扩张，炎性细胞浸润明显，耳部炎性症状维持并逐渐加重至d 15；与正常小鼠相比， MC903使右耳组织匀浆中TSLP水平于d 3明显升高，随后逐渐下降，IL-4、IL-33水平于d 7明显升高，随后逐渐降低。外淋巴结中 DC 的表面标记分子CD40＋、CD86＋和ILC2的含量在d 7和d 15均有上升。结论每耳2 nmol MC903诱导小鼠7 d可成功建立小鼠特应性皮炎模型，TSLP较适检测点为d 3，IL-4、IL-33较适检测点为d7。
【期刊名称】euniq 5《中国药理学通报》
【年(卷),期】2016(032)007
【总页数】6页(P1027-1032)
二手越野车交易市场
【关键词】卡泊三醇;小鼠特应性皮炎;胸腺基质淋巴细胞生成素;白细胞介素-33;白细胞介素-4;树突状细胞;Ⅱ型固有淋巴细胞
【作 者】王璨;王晓钰;于曦;陶羽;王燕;包凯帆;季律;洪敏
【作者单位】南京中医药大学药学院，科技部国家规范化中药药理实验室，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京 210023;南京中医药大学药学院，科技部国家规范化中药药理实验室，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京 210023;南京中医药大学药学院，科技部国家规范化中药药理实验室，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京 210023;南京中医药大学药学院，科技部国家规范化中药药理实验室，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京 210023;南京中医药大学药学院，科技部国家规范化中药药理实验室，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京 21
0023;南京中医药大学药学院，科技部国家规范化中药药理实验室，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京 210023;南京中医药大学药学院，科技部国家规范化中药药理实验室，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京 210023;南京中医药大学药学院，科技部国家规范化中药药理实验室，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京 210023
【正文语种】中 文
【中图分类】R-332;R363-332;R392.12;R758.2
特应性皮炎(AD)是一种慢性炎症性皮肤病，伴随着皮肤瘙痒，易复发，并且影响着各个年龄段的人。AD患者有较高的患严重的过敏性疾病、精神疾病以及皮肤感染[1]几率。AD的重点在于恢复和维持皮肤屏障功能、减轻炎症，以及对过敏性疾病关键启动因子和通路进行抑制。研究AD的发病机制和防治措施是当前皮肤病研究领域的热点之一。
建立理想的AD动物模型是研究AD的基础，现在小鼠AD模型的主要制作方法有卵蛋白(OVA)诱导的皮肤主动过敏反应[2]、二硝基氟苯(DNFB)诱导的小鼠耳部三相皮肤反应[3]、
异硫氰酸荧光素(FITC)等半抗原重复刺激诱导的皮肤反应[4 ]以及通过转基因和基因敲除产生的特应性皮炎小鼠模型。卡泊三醇(MC903)是一种人工合成维生素D3的类似物，广泛用于银屑病[5]，并且能够抑制白血病细胞的增殖分化[6]。近年来，有研究表明，局部应用MC903能引起小鼠特应性皮炎综合征，同时MC903能够通过上皮角质形成细胞维生素D受体(VDR)引起胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的高表达[4]。TSLP是一种上皮细胞来源的细胞因子，在起始和促进Tp细胞介导的过敏性炎症中起关键作用[8]。因此，基于TSLP研究特应性皮炎具有重要的意义。但模型建立的条件文献报道差异较大，MC903的剂量及随着时间模型中关键细胞因子及效应细胞的变化趋势不明确，因此，本研究通过探索MC903诱导的TSLP高表达的小鼠特应性皮炎模型的最适条件，为研究过敏性疾病的发病机制以及措施提供帮助。
1.1　仪器　测厚规，日本Mitutoyo公司，型号：7301；电子天平，瑞典Mettler-Toledo公司，型号：PL203；酶标仪，美国Bio-Tek公司，型号：SyneRgy 2；冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司，型号：GS-15R；流式细胞仪，美国BD公司，型号：Accuri C6。
1.2　实验动物　BALB/c小鼠，♂，SPF级，体质量18～22 g，SPF级，北京维通利华实验日产新阳光怎么样
动物技术有限公司，生产许可证号码：SCXK(京)2012-0001。饲养于南京中医药大学动物实验中心SPF级环境中，环境温度为22℃～25℃，湿度为50%～65%，实验前动物均进行1周适应性饲养。
1.3　主要试剂　卡泊三醇(MC903)，Tocris，批号：112965-21-6；小鼠TSLP ELISA试剂盒，eBioscience，批号：E09338-1631；小鼠IL-33 ELISA试剂盒，eBioscience，批号：E11107-1643；小鼠 IL-4 ELISA试剂盒，eBioscience，批号：E09338-1631；小鼠 IFN-γ ELISA试剂盒，eBioscience，批号：E09342-1631；PE-抗小鼠CD40抗体,eBioscience，批号：E028955；APC-抗小鼠CD86抗体，eBioscience，批号：E028452；FITC-抗小鼠Lineage cocktail抗体，BioLegend，批号：B174972；PE-抗小鼠CD25抗体eBioscience，批号：E01153-1633；APC-抗小鼠ST2/IL33R抗体，eBioscience批号：E19489-80；总蛋白定量试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20131212。
苏州汽车南站到周庄
1.4　动物分组及处理
1.4.1　MC903诱导的小鼠特应性皮炎剂量探索实验　BALB/c小鼠按体质量分层法随机分成4组，每组12只：包括1个空白组，3个剂量组(0.33、1、3 nmol·ear-1 )，MC903溶于体
积分数为0.95的乙醇涂布于每个小鼠右耳，左耳涂等剂量乙醇溶剂，每耳涂布体积为20 μL[9]。从d 0起每天连续处理至d 6。每天测量小鼠的耳厚(d 0给药前测耳厚)，分别于d 3、d 7每组取6只小鼠的耳组织进行匀浆制备。
1.4.2　MC903诱导的小鼠特应性皮炎时间探索实验　BALB/c小鼠按体重分层法随机分成6组，每组7只，包括：1个空白组、5个剂量组(分别诱导1、3、7、11、15 d)。2 nmol MC903溶于体积分数为0.95的乙醇涂布于每个小鼠右耳，左耳涂等剂量乙醇溶剂，每耳涂布体积为20 μL[9]。每天测量小鼠的耳厚(d 0给药前测耳厚)，分别于d 1、3、7、11、15取小鼠的耳组织和颈部淋巴结，分别进行匀浆制备、病理组织学检查及流式细胞仪分析。
suv新胜达1.5　小鼠耳肿胀度检测及耳组织病理学检查　每天测定小鼠两耳厚度，计算耳肿胀度(右耳厚度-左耳厚度)，并于取材时测定小鼠两耳重量差值(右耳重量-左耳重量)。取小鼠耳廓固定后，从耳根至耳尖切开，取半只耳廓，垂直于切面石蜡包埋，常规切片，HE染，光镜下在耳廓全长的中点左右各取同倍率视野拍照。
1.6　耳匀浆的制备与细胞因子表达水平的检测　将小鼠用直径8 mm的皮肤圆形打孔器摘取右耳耳片标本，称重，用PBS溶液研磨成2.5%的耳组织匀浆，静置后，放置于4℃离心
机进行4 000 r·min-1的转速低温离心15 min，获得标本上清液。采用ELISA技术检测匀浆中细胞因子IL-4、IFN-γ、TSLP、IL-33的表达水平，并用蛋白含量BCA法检测样本总蛋白水平后进行蛋白矫正，炎性细胞因子的表达水平表示为μg·g-1 Pro。
长安沃尔沃s401.7　流式检测Ⅱ型固有淋巴细胞(ILC2s)及树突状细胞(DCs)表面标记分子CD40+、CD86+在淋巴细胞内的百分含量　小鼠取材时分离颈部皮肤，收集颈部淋巴结，用机械研磨法在生理盐水中制备单细胞悬液，经200目滤布过滤后，调整细胞密度为每毫升12×107个 。ILC2s细胞的检测：取上述制备得的细胞悬液100μL于离心管中，分别加入0.2 μg CD25抗体、0.2 μg IL-33R/ST2抗体、Lineage cocktail抗体(每管20 μL)避光孵育15 min,经生理盐水充分洗涤后(每次1 mL，共2次)，用500 μL生理盐水重悬，流式细胞仪检测。DCs表面标记分子CD40+、CD86+的检测：取100 μL细胞悬液，分别加入0.2 μg CD40抗体及0.2 μg CD86抗体，避光孵育15 min，经生理盐水充分洗涤后(每次1 mL，共2次)，用500 μL生理盐水重悬，流式细胞仪检测活化的DC细胞(CD40+CD86+)和ILC2细胞(Lin-CD25+ST2+)的百分含量。
1.8　统计学方法　数据以表示，应用GraphPad Prism 5.0统计软件，两组组间比较采用student t-test检验，多组间比较采用One-way Anova (Dunnet’t)。
2.1　MC903诱导特应性皮炎剂量探索实验
2.1.1　小鼠耳肿胀度检测　从d 0起，小鼠右耳分别涂布0.33、1、3 nmol MC903，连续诱导7 d。结果表明，与对照组比较，各模型组耳厚差随MC903诱导剂量和天数的增加而增加(Fig 1A)，MC903诱导3 d后，3 nmol剂量组耳重有明显增加(Fig 1B)，攻击7 d后，1、3 nmol剂量组耳重均明显增加(Fig 1C)。
2.1.2　耳匀浆中细胞因子的表达　从d 0起，小鼠右耳分别涂布每耳0.33、1、3 nmol MC903，每耳连续诱导7 d。ELISA法测定耳匀浆上清液中过敏性疾病关键启动因子TSLP、IL-33及炎症因子IL-4的表达。结果表明：d 3和d 7 1、3 nmol剂量组TSLP水平与空白组相比均升高，而d 3 3 nmol组表达最高,d 7 1 nmol组表达最高(Fig 2A)。MC903攻击3 d后各剂量组IL-33表达水平与空白相比差异均无显著性，攻击7 d后3 nmol组与空白相比有明显增加(Fig 2B)。3 nmol组耳组织匀浆中Ⅱ型炎症因子IL-4在d 3、d 7的表达水平与空白组相比均增加(Fig 2C)。