血脑屏障氧糖剥夺再灌体外模型小鼠脑内皮细胞bEnd.3中微小RNA-290b-3p的作用及机制研究
张奕雯1a，凡子莲1a，李经伦2，熊兰1a，赵自胜1b，李超1a
作者单位：1广元市第一人民医院，a神经内科，b放射科，四川广元628000；
2西南医科大学附属医院神经内科，四川泸州646000
摘要：目的探讨氧糖剥夺再灌（OGD/R）条件下，小鼠脑内皮细胞bEnd.3中微小RNA-290b-3p（miR-290b-3p）在体外血脑屏障模型的作用与机制。方法培养小鼠脑内皮细胞bEnd.3，建立OGD/R模型与体外血脑屏障模型，Transwell法检测氧糖剥夺
后体外血脑屏障模型通透性的变化；实时荧光定量聚合酶链式反应（real time-PCR，RT-PCR）检测OGD/R后miR-290b-3p表达
水平；Targetsc站预测miR-290b-3p与紧密连接蛋白5（Claudin-5）结合；荧光素酶报告实验验证miR-290b-3p与Claudin-5
结合；转染bEnd.3细胞miR-290b-3p抑制剂，应用蛋白质印迹法（Western Blot）检测Claudin-5的表达，Transwell法检测抑制miR-290b-3p后氧糖剥夺后体外血脑屏障模型通透性变化。结果OGD/R后体
外血脑屏障破坏，1、2、3、4、6h荧光素异硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖扩散速率分别为（0.04±0.00）、（0.04±0.01）、（0.05±0.01）、（0.07±0.01）、（0.12±0.01）pmol·mm-2·min-1，通透性增
加；miR-290b-3p在OGD/R后1、2、3、4、6h表达量分别为（1.18±0.12）、（1.27±0.12）、（1.55±0.18）、（2.13±0.18）、（2.53±0.15），表达
增加；miR-290b-3p与Claudin-5结合；抑制miR-290b-3p可以缓解OGD/R后Claudin-5的降低，减轻血脑屏障的损伤。结论氧
糖剥夺后bEnd3细胞中miR-290b-3p表达增加抑制miR-290b-3p可通过调节Claudin-5表达减轻氧糖剥夺模型中血脑屏障的
损伤。
关键词：卒中；缺氧缺血，脑；再灌注损伤；氧糖剥夺；血脑屏障；紧密连接蛋白；Claudin-5；微小RNA Study on the role and mechanism of miR-290b-3p in brain endothelium bEnd.3of
blood-brain barrier oxygen-glucose deprivation
ZHANG Yiwen1a,FAN Zilian1a,LI Jinglun2,XIONG Lan1a,ZHAO Zisheng1b,LI Chao1a
Author Affiliations:1a Department of Neurology,1b Department of Radiology,The First People's Hospital of Guangyuan, Guangyuan,Sichuan628000,China;2Department of Neurology,The Affiliated Hospital of
Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan646000,China
Abstract:Objective To explore the role of miR-290b-3p in the blood-brain barrier model in vitro under oxygen-glucose depriva‑tion and reperfusion conditions.Methods Mouse brain endothelial cells bEnd.3were cultured,oxygen glucose deprivation reperfusion model(OGD/R)and blood-brain barrier model in vitro were established,Transwell method was used to detect the permeability of blood-brain barrier model in vitro after oxygen glucose deprivation,and miR-290b-3p expression level after OGD/R was detected by real time-PCR.Targetscan algorithm was used to predict the interaction of miR-124and Claudin-5;the binding of miR-290b-3p and Claudin-5 was detected by Luciferase;transfection of miR-290b-3p inhibitor in bEnd3cells and detection of Claudin-5expression by Western Blot and permeability of blood-brain barrier model in vitro.Results After OGD/R,the blood-brain barrier was destroyed,the diffusion rates of fluorescein isothiocyanate(FITC)-dextran were(0.04±0.00),(0.04±0.01),(0.05±0.01),(0.07±0.01),(0.12±0.01)pmol·mm-2·min-1.at1,2,3,4,and6h,respectively,and permeability increased.The expression of miR-290b-3p increased
after OGD/R[1,2,3,4, 6h:(1.18±0.12),(1.27±0.12),(1.55±0.18),(2.13±0.18),(2.53±0.15)];miR-290b-3p combined with Claudin-5;inhibition of miR-290b-3p reversed decrease of Claudin-5and alleviated the damage of the blood-brain barrier during OGD/R.Conclusion The expression of miR-290b-3p is increased induced by OGD/R in bEnd3,inhibition of miR-290b-3p attenuates blood-brain barrier damage in the oxy‑gen-sugar deprivation model by modulating Claudin-5expression.
Key words:Stroke;Hypoxia-Ischemia,brain;Reperfusion injury;OGD/R;BBB;Tight junction protein;Claudin-5; microRNA
中风是最具破坏性的疾病之一，排名为全世界死亡的第二大原因。中风可分为缺血性中风和出血性中风。世界卫生组织（WHO）将中风定义为由脑血管病变导致的快速发展的脑功能局灶性或全
◇临床医学
◇
引用本文：张奕雯，凡子莲，李经伦，等.血脑屏障氧糖剥夺再灌体外模型小鼠脑内皮细胞bEnd.3中微小RNA-290b-3p的作用及机制研究［J］.安徽医药，2021，25（2）：345-348.DOI：10.3969/j.issn.1
009-6469.2021.02.032.
局性紊乱的临床症状，症状持续至少24h，严重将导致死亡［1］。缺血性中风的核心事件是大脑组织的血液供应中断，进一步导致缺氧和营养物质缺乏并加剧脑损伤。多年来，缺血性中风过程中的病理机制如细胞凋亡、炎症、氧化应激和脑水肿等得到深入研究。然而，目前对于缺血性中风的仍具有很大局限，缺乏具有特定功效的药物。
血脑屏障破坏在缺血性中风诱导的脑损伤中起关键作用。缺血性中风引起的内皮功能障碍，增加微血管通透性，导致血脑屏障渗漏，随后引起脑水肿和出血性转化，并促进炎症反应，从而加重脑损伤。因此，在缺血期间保持血脑屏障完整性对中风管理具有重要意义并且需要进一步研究。最近的研究表明微小RNA（miRNA）可以调节各种中风危险因素和疾病前期机制，促进或抑制miRNA的表达可能有益于中风后恢复［2］。有关miRNA在中风后血脑屏障破坏的作用及机制尚不清楚。
本研究自2019年3月采用体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3细胞，氧糖剥夺再灌模型（oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）模拟体内脑中风损伤，通过检测miR-290b-3p的表达以及抑制miR-290b-3p对体外血脑屏障模型通透性的影响，探讨miR-290b-3p在体外氧糖剥夺模型下血脑屏障破坏的作用及机制。
1材料与方法
1.1材料小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3（ATCC细胞库），DMEM/F12培养基（Sigma），胎牛血清（FBS）（杭州四季青），紧密连接蛋白5（Claudin-5）抗体（Proteintech），miR-290b-3p特异性引物（（Ribo‑
Bio），miR-290b-3p抑制剂（吉玛基因）。
1.2方法
1.2.1细胞培养小鼠脑内皮细胞系bEnd.3在37℃细胞恒温箱中孵育，DMEM/F12补充有10％（V /V）的FBS，青霉素（100U/mL）和链霉素（100U/ mL）。小鼠脑微血管内皮bEnd.3细胞在4~10次传代后用于实验。
1.2.2体外血脑屏障bEnd.3以2.5×105的密度接种到Transwell小室内腔（0.4μm孔径）。使细胞生长5d以实现汇合。为了评估细胞旁通透性，将荧光素异硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖（70kDa；Sigma-Al‑drich）以1μmol/L的浓度添加到腔室中。在OGD后1、2、3、4、6h，使用来自下腔（外）室的30μL培养基，用荧光读数器测量荧光强度，其中在每次测量前30min用新鲜培养基替换原培养基。样品中示踪剂的浓度由使用已知浓度的示踪剂拟合的标准曲线计算。确定示踪剂从上腔室到下腔室的扩散速率，表示为pmol·mm-2·min-1。
1.2.3OGD/R为了在体外模拟缺血，提前将bEnd.3细胞铺板，接种到24孔板中。先吸去正常培养基，用PBS清洗细胞两次，加入无糖DMEM培养基，24孔板放入厌氧罐中。将厌氧罐放入恒温（37℃）细胞培养箱中，对细胞进行缺糖、缺氧损伤。1h后复灌，换成正常培养基，放入恒温细胞培养箱中分别培养至设定时间参数，以供血脑屏障研究观测使用。
1.2.4实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）测定首先，使用TRIzol试剂提取总RNA。然后，使用用于qPCR试剂盒（R133-01，Vazyme Biotech）逆转录miRNA-290b-3p。接下来，进行实时荧光定量PCR检测成熟miR-290b-3p的表达。
1.2.5蛋白质印迹法（Western Blot）在冰上使用细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白。4℃，12000g 离心20min。BCA蛋白定量。12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转法将蛋白转印至PVDF 膜上。用TBST洗涤PVDF膜3次，每次15min。5%脱脂牛奶室温封闭2h。加入一抗（claudin-5，1∶1 000），4℃过夜。用TBST洗3次，每次15min。室温孵育二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，1∶2000）2h。用TBST洗3次，每次15min。用化学发光显法显影，拍照统计。
1.2.6荧光素酶基因报告实验根据Targetscan软件预测miR-290b-3p与Claudin-5mRNA3’-UTR区结合序列。将含该结合位点的片段插入到荧光素酶报告基因质粒。构建两组质粒：包含该结合位点的野生型质粒（Claudin-53’UTR WT）以及突变该结合位点的突变质粒（Claudin-53’UTR Mut）。转染bEnd.3
细胞miR-290b-3p（Robbio）和两组质粒，摩尔比为50∶1。miRNA对照用作阴性对照。转染后24 h按照制造商的方案（Promega，E2920）进行测定荧光素酶活性测定。
1.3统计学方法数据采用SPSS17.0软件包进行分析。观测资料主要为计量数据，均通过正态性检验。以x±s描述，两组比较采用两独立样本t检验或校正t检验。多时点资料比较为重复测量方差分析+组间LSD-t检验+组内差值t检验。趋势分析为计量资料行两分类转化后的Cochran Armitage趋势检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1体外OGD/R模型下血脑屏障通透性增加构建体外血脑屏障模型，见图1。在OGD/R后，血脑屏障在4h和6h遭到破坏，对FITC-葡聚糖通透性明显增加，与对照组及与1h比较，各时间点FITC-葡聚糖（70kDa）血脑屏障通透量均差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
此外，再以OGD/R 组FITC -葡聚糖（70kDa ）数据的总均值为界值，将OGD/R 组每个样本转化成两分类计数资料，行Cochran Armitage 趋势检验，结
果提示其通透性有随时间增加的趋势（χ2=25.046，P <0.05）。
2.2OGD/R 后miR -290b -3p 表达增加在OGD/R
后，小鼠脑内皮细胞bEnd.3中miR -290b -3p 表达呈时间依赖性升高。与对照组及与1h 比较，各时间点miR-290b-3p 表达量均差异有统计学意义（均P <0.05）。见表2。
2.3
miR -290b -3p 与Claudin -5mRNA 结合利用
miRNA 靶基因预测软件Targetscan 预测出miR -290b -3p 与Claudin -5直接结合，见图2。荧光素酶实验miR -290b -3p 与Clauldin -5的结合，结果见表3。2.4敲低miR -290b -3p 缓解OGD/R 后血脑屏障的破坏
抑制OGD/R 后miR -290b -3p 的表达可以改善
bEnd.3细胞OGD/R 后Claudin -5的降低现象，并且抑制mi -290b -3p 的表达可降低体外血脑屏障模型对FITC -葡聚糖的通透性。结果图3。
3讨论
血脑屏障在维持中枢神经系统稳定中发挥重
车模潜规则要作用，其可以将神经系统与外周免疫系统分开，防止大脑受到有毒物质的影响；同时，血脑屏障可以阻碍大分子物质进入脑内［3］。在缺血性脑损伤中，血脑屏障的通透性完整性遭到破坏，并诱导脑水肿，加重脑损伤。因此探究缺血性中风后血脑屏障的损伤机制具有重要意义。
本研究发现OGD/R 后体外血脑屏障模型的通透性增加，并伴随着miR -290b -3p 的表达增加。miRNA 是长度约22个核苷酸的单链非编码RNA 分子，其通过与mRNA 分子的3'非翻译区（UTR ）结合
并使促进mRNA 降解或抑制它们的翻译而充当基因表达的调节剂［4］。miRNA 分析技术（微阵列分析）在缺血性脑损伤中的应用始于2008年［5］。研究发现miRNA 对脑缺血中下游靶基因具有潜在调节作用，从而在缺血性脑损伤中发挥重要作用［6］。
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交通违规查询7
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体外BBB 模型
0.4μm 孔径
bEnd.3
Transwell
FITC-葡萄糖
图1构建体外血脑屏障模型
表1
OGD/R 后各时间点FITC-葡聚糖（70kDa ）血脑屏障通透性比较/（pmol·mm -2·min -1，x ±s ）
组别对照组OGD/R 组t 值P 值
转向助力泵
0h
0.029±0.0040.033±0.0041.7320.1141h台州交警违章
0.034±0.0060.037±0.0050.9410.3692h
0.038±0.0060.043±0.0061.4430.1803h
0.042±0.0070.052±0.0072.4740.0334h
0.044±0.0070.073±0.0067.7050.0006h
0.050±0.0070.116±0.00716.3310.000
注：整体分析为两因素重复测量方差分析，资料球形性校正采用HF 系数法；组间F =148.055，P <0.001；时间F =124.238，P <0.001；交互
F =51.994，P <0.001。
表2
OGD/R 后各时间点miR-290b-3p 表达量比较/x ±s
组别对照组OGD/R 组t 值P 值
1h
1.00±0.101.18±0.12
2.8230.018
2h
1.00±0.101.27±0.124.2340.002
3h
1.00±0.101.55±0.186.5430.000
4h
1.00±0.10
佛山二手车迷网2.13±0.181
3.4420.000
6h
1.00±0.10
2.53±0.1520.7890.000
注：整体重复测量方差分析（HF 系数：0.3414），组间F =872.670，P <0.001；时间F =54.686，P <0.001；交互F =54.562，P <0.001。
表3
miR -290b -3p 与claudin -5结合数据/（n =6，x ±s ）
组别对照组
猎豹汽车重整方案出炉
miR-290b-3p 组t 值P 值
Claudin-5
3'UTR WT 1.00±0.020.58±0.0616.2670.000Claudin-5
3'UTR Mut 1.11±0.031.20±0.035.196
0.000图2miRNA 靶基因预测软件Targetscan 预测miR -290b -3p
与Claudin -5直接结合结果
2
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8910115
7
8注：1―GDPDH;2―Claudin-5；3―OGD/R 前对照组；4―OGD/R 前miR-290b-3p 组；5-OGD/R 后对照组；6―OGD/R 后miR-290b-3p 组。图3
敲低miR -290b -3p 缓解OGD/R 后血脑屏障破坏的
条带图
Claudin-5是血脑屏障中的紧密连接蛋白。大量研究表明，Claudin-5可调节血脑屏障的完整性和通透性［7］。并且Claudin-5表达的增加在神经系统疾病中起着神经保护作用，特别是在脑缺血性中风中。此外，Claudin-5可能是缺血性中风早期出血性转化检测的潜在标志物［8］。介于Claudin-5在维持血脑屏障完整性和通透性中的重要作用，目前开发出药物，激素，受体靶向，基因和物理等方法，旨在通过Claudin-5调节血脑屏障达到缺血性中风的目的［9-13］。这些证据表明，Claudin-5在缺血性中风中对维持BBB完整性起着重要作用。在缺血性脑中风后，Claudin-5的表达降低，这会导致BBB的破坏，导致脑损伤加剧［14-15］。然而，目前许多问题仍未得到解决。例如，中风后Claudin-5表达降低的机制是什么？虽然前期有研究发现基质金属酶（MMP）可介导脑缺血后大鼠血脑屏障中claudin-5的破坏［9］，但是脑中风后Claudin-5的破坏是否涉及其他机制仍需继续研究。鉴于miRNA在基因表达中调控作用，本研究通过miRNA 靶基因预测及荧光素酶报告实验发现miR-290b-3p 直接靶向Claudin-5。本研究发现miR-290b-3p对Claudin-5具有调节作用，下调OGD/R后miR-290b-3p的水平，Claudin-5的表达增加，并且体外血脑屏障模型对FITC-葡聚糖的通透性降低，这表明下调miR-290b-3p可促进Claudin-5的表达从而发挥血脑屏障保护作用。
本研究结果表明，小鼠脑内皮细胞bEnd3中miR-290b-3p在OGD/R后表达增加，这会增加miR-290b-3p与Claudin-5mRNA的结合，促进Claudin-5 mRNA的降解，这可能是Claudin-5在OGD/R后降低的原因之一。因此抑制OGD/R后miR-290b-3p表达上调可通过增加Claudin-5的表达来保护BBB完整性。综上，miR-290b-3p可能作为预防中风后BBB 破坏的靶点。
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（收稿日期：2019-10-07，修回日期：2019-11-20）