药材(饮片)及成方制剂显微鉴别法标准操作规程
目的：建立药材(饮片)及成方制剂显微鉴别法标准操作规程
范围：适用于药材(饮片)及成方制剂显微鉴别操作
职责：QC检验员对本标准实施负责
执行标准：《中国药典》2020年版四部第230页通则2001
2020改装
规程：
1简述：
显微鉴别法系指用显微镜对药材(饮片)切片、粉末、解离组织或表面制片及含饮片粉末的攵剂中饮片的组织、细胞或内含物等特征进行鉴别的一种方法，鉴别时选择具有代表性的供试品，根据各种鉴别项的规定制片。制剂根据不同剂型适当处理后制片。
1.1药材性状鉴别特征不明显或外形相似而组织构造不同；
1.2药材破碎不易辨认或区分；
1.3药材呈粉末或为成方制剂；
1.4用显微化学方法确定药材中有效成分组织的分布状况及其特征。
在进行显微鉴别时，首要将“检样”制成适于镜检的标本。对于完整的药材可制成各种切面片；对粉末药材（包括丸、散等中成药）或直接装片或作适当处理后制片。
2仪器与用具
1.1仪器生物光学显微镜
1.2用具
2.2.1放大镜、刀片、解剖刀、镊子、剪刀、解剖针
2.2.2载玻片、盖玻片。
2.2.3吸湿器（即玻璃干燥器改装蒸馏水加微量苯酚，潮气润湿药材样品用）、培养皿或小烧杯（放切片用，切片后的处理均可在其中进行）、酒精灯、铁三角架、石棉网、滴瓶、试管、试管架、滴管玻璃棒（粗与细）、乳钵、量筒。
2.2.4毛笔（从刀上刷取切片用）、铅笔（HB、4H、6H绘图用）、带盖搪瓷盘（装切片标本
用）、纱布、吸水纸（滤纸）、火柴等。
3.1 水合氯醛试液取水合氯醛50ｇ，加水15ml与甘油10ml使溶解，即得。
3.2 甘油醋酸试液（斯氏液）取甘油、冰醋酸与水各等份，混合即得。
3.3 甘油-乙醇溶液取甘油1份，50%乙醇1份，混合即得。
3.4 苏丹III试液取苏丹III 0.01ｇ，加90%乙醇溶解后加甘油5ml，摇匀即得。本液应置棕玻璃瓶内保存，在2个月内应用。
3.5 钌红试液取10%醋酸钠溶液1-2ml，加钌红适量使呈红即得。本液应临用新制。
3.6 间苯三酚试液取间苯三酚1g，加90%乙醇100ml使溶解，滤过即得。置棕玻璃瓶内，在暗处保存。
3.7 碘试液取碘化钾0.5g，溶于少量中，加碘1g，使溶解，加水至100ml即得。应用时通常再加水稀释
成淡棕或黄。本液应置棕瓶内保存。
3.8 硝铬酸试液取硝酸10ml加入100ml水中，混匀。另取铬酸10g，加水100ml使溶解。用时将二液等量混合，即得。此液为常用的“植物组织解离液”。检品的解离浸泡时间，按材的质地不同而异。
3.9 ａ-萘酚试液取15%的ａ-萘酚乙醇溶液10.5ml，缓缓加入硫酸6.5ml，混匀后加乙醇40.5ml及水4ml，混匀即得。此液用于检查菊糖染成紫红，并很快溶解。
3.10 试液（米隆氏试液）取汞
4.5g，加发烟硝酸3ml，使作用完毕，加等量水稀释即得。本液应置棕玻璃瓶内。此液用于检查木质化与纤维素细胞壁，前者显黄棕，后者显蓝或紫。
4 药材（饮片）显微制片
4.1横切片或纵切片制片
4.1.1药材的预处理先将药材表面泥沙刷干净，将应观察的部位，切成适当小的块或段，一般以宽1cm、3cm为宜，切面削平整。质地软硬适中药材可直接进行切片；质地坚硬的则须先使其软后再切片。软化方法可放在湿器（即玻璃干燥器底蒸馏水并滴数滴苯防霉，上部瓷板上置药材样品吸湿）中
闷润，或在水中浸软或煮软，有些根、根茎、茎及木类药材，质地虽坚实，可将削平的切面浸水中片刻，表面润湿时取出，直接切片也能切成较完整的薄片。过于柔软而薄的药材，如种子或叶片，不便直接手持切片，种子类可放在软木
塞或橡皮片中（一侧切一窄缝，将种子嵌入其中），叶类药材可用质地松软的通草或向日葵的茎髓作夹持物进行切片。
药材在预处理时应注意不能影响要观察的显微鉴别特征。如要观察菊糖粘液等在软化、切片、装片过程中，均不可与水接触，以免溶解消失；观察挥发油、树脂等则不可与高浓度乙醇或其它有机溶媒接触。
4.1.2徒手切片在检验工作中，此法最常用，操作简便，迅速，制成的切片保持其细胞内含物的固有形态，便于进行各种显微化学反应观察。
4.1.2.1切片右手片，左手拇指和食指夹持材，中指托着药材的底部，使药材略高出食、拇二指，肘关节应固定，使材料的切面保持水平，刀口向内并使刀刃自左前方向右后方切削，即可切得薄片。操作时，材料的切面和刀刃须经常加水或50%乙醇保持湿润，防止切片在刀片上。切好的切片用毛笔蘸水轻轻从刀片上入盛有水50%乙醇培养皿中。4.1.2.2徒手圆筒生物切片器切片将药材用通草或软木夹持，固定于切片器持物筒中；具有一定硬度的材料（如木本植物茎干等）可直接固定于持物筒中；
左手持切片器，拇指与小指持底盘的边缘，食指端顶动中柱上的固定螺帽，可使材料无级上升，每动一格材料上升约10ｕm，顶动螺帽时，同时将底盘向反方向略转动，使切片器整体方向不变，以保持材料的切片方向固定；右手持切片刀，刀柄靠于拇指根部，食指与中指轻压于刀片的上面，刀片平贴于切片器圆台上，由左上方至右下方迅速滑动，切下的切片用毛笔沾水取下置盛水的培养皿中。
4.1.2.3装片先取薄而平整的切片置载玻上，根据所要观察的内容要求，滴加适宜的试液1～2滴，盖好盖玻片，即可在显微镜下观察。如加水合氯醛试液透化，将薄片移载玻片上，滴加1-2滴水合氯醛试液，在酒精灯上微微加热，至边缘起小泡即停止加热，继续补充试液再加热以不烧干为度直至透化完全为止；加热温度不能过高，以防水合氯醛试液沸腾，使组织内带入气泡；加热时应将载玻片不断移动，不宜对准一处烧，以免受热不匀而炸裂；透化后放冷，加甘油乙醇试液1-2滴后加封盖片，贴上标签。冬日温较低时，透化后不待放冷即滴加甘油乙醇液，能清楚观察组织构造，可溶解淀粉粒、蛋白质、叶绿体、树脂、挥发油等，对草酸钙结晶无用，为观察草酸钙结晶的良好试剂。如需观察菊糖等一些多糖物质则如水合氯醛试液不加热。
4.2粉末制片主要用于粉末状的药材及药材末制成的成方制剂观察。
4.2.1粉末制备药材要先干燥，磨或锉成细粉，装瓶，贴上标签。粉末制备时，注意取样的代表性，应注意各部位的全面性，例如：根要切取根头、根中段及根尾部位，必须全部磨成粉，不得丢弃渣头。
并需通过4号筛或5号筛，混合均匀，干燥时，一般温度不能超过60℃，避免经受高温，使淀粉糊化，难以观察其完整者。
4.2.2制片法用解剖针挑取粉末少许，置载玻片的中央偏右位置，加适宜的试液1滴，用针搅匀（如为酸或碱应用细玻棒代针），待液体渗入粉末时，用左手食指与拇指夹持盖玻片的边缘，使其左侧与药液层左接触，再用右手持小镊子或解剖针托住盖玻片的右侧，轻轻下放则液体逐渐扩延充满盖玻片下方。如液体未充满盖玻片，应从空隙相对边缘滴加液体，以防产生气泡；若液体过多，用滤纸片吸去溢出液体，最后在载玻片的左端贴上检品的标签或书写上标记。
4.2.3中药成方制剂的鉴别按剂型不同，分别将样品处理后，按粉末制片法观察。
4.2.4片剂，可取2-3片研细后，取粉末适量装片或透化装片。
4.2.5  粉末制片注意事项
4.2.
5.1粉末加液体搅拌及加盖玻片时容易产生气泡。如用水或甘油装片时，可先加少量乙醇使其润湿，可避免或减少气泡的形成，或反复将盖玻片沿一侧轻抬，亦可使多数气泡逸出。搅拌时产生气泡可随时用针将移出。
4.2.
5.2装片用的液体如易挥发，应装片后立即观察。用水装片也较易蒸发而干涸，通常滴加少许甘油可延长保存时间。
4.2.
5.3需用水合氯醛试液透化时应注意掌握方法。装片后用手执其一端，保持水平置小火焰上约1～2cm处加热，并缓缓左右移动使之微沸，见气泡逸出时离开火焰，待气泡停止逸出再放在小火上，并随时补充蒸发的试液，如此反复操作，直至粉末呈透明状止，放凉后滴加甘油镜检。
4.2.
5.4粉末药材制片时，每片取用量宜少不宜多，为使观察全面，可多做些制片。如取量多显微特征单一轮廓不清，反而费时，不易得出准确结论。中成药制剂的粉末检查，因在多味药材粉中寻一味药的某一显微特征，有时较难查见，可以取粉末量多些，置试管或小烧杯中加入水合氯醛试液，加热透化，透化后再用吸管吸出。滴在载玻片上，加盖玻片，即可观察
4.3表面制片主要用于叶类、花类（萼片、花瓣）、果实、草质茎等药材的表面特征如毛
茸、气孔、表皮细胞等的观察。质地菲薄的药材可以整体装片；较厚的药材须撕下表皮然后装片。
4.3.1整体装片适用于较薄的叶片、萼片和花瓣。剪取欲观察部位4mm2的两小片，一反一正放在载玻片上，加水合氯醛液，加热透化透明为止盖好玻片即得。
另法：剪取欲观察薄片8mm2，置试管中加水合氯醛试液加热透化，然后至载玻片上，切成相等两部分，其中一片翻过来，与一片并列，再加1～2滴封液，盖好玻片即得。
4.3.2表面撕离装片凡较厚的或新鲜药材，用法不能使之透化或便于整体装片。将软化了或新鲜材料固定住，然后用镊子夹住要剥取撕离的部分，小心的撕离，可用解剖刀轻轻割（刮）不需要的各层组织，只保留表皮层（上层或下层），欲观察的表皮表面朝上，置载玻片上，加透化剂透化后，放冷，另加稀甘油1滴，盖上玻片，贴品名签，即得。
4.4  解离组织制片适用于厚壁组织或输导组织等的单个细胞的显微观察。将样品切成段（约5mm，粗约2mm）或片（厚约1mm），对于木类或茎类木质部，最好组织较多或集成较大束，可用硝铬酸法或氯酸钾法；对于薄壁组织占大部分，木化组织少或分散存在的样品，要用氢氧化钾法。
4.4.1氢氧化钾法置样品于试管中，加5%氢氧化钾溶液2～5ml，加热至用玻璃棒挤压，能离散为止，倾去碱液，加水洗涤后，取出少量置载片上，用解剖针撕开，以稀甘油装置观察。
4.4.2硝铬酸法置样品于小烧杯管中，加20%硝酸与20%铬酸的等量混合液适量，使之浸没样品，放置
约30～60分钟，坚硬的样品需时要长些，也可在水浴上微温，用玻璃棒挤压能离散为止，倾去酸液，用水洗涤后，取出少量置载玻片上，用解剖针撕开，以稀甘油装置观察。
4.4.3氯酸钾法置样品于试管中，加硝酸溶液（1～2ml）及氯酸钾少量，缓缓加热，待产生的气泡渐少时，再及时加入氯酸钾少量以维持气泡稳定地发生，至用玻璃棒挤压能离散为止。倾去酸液，用水洗涤后，撕开，封藏。
4.4.4注意事项用氯酸钾法制片时，每次加入氯酸钾不可过多，加热温度不宜过高，否则突沸容易使液体逸出管外。加热时间长短因样品硬度和木化程度而异，通常约需5-15分钟。操作过程中生的有毒，应注意通风。
用硝铬酸法解离也可在载玻片上进行。即取一块厚度适当的切片，置载玻片上，滴加硝铬