自噬的分子标志物研究论文
自噬的分子标志物研究论文
在生理状态下, 细胞通过自噬 (autophagy) 清除衰老细胞器和突变蛋白, 以维持自身结构稳定和功能正常。自噬还参与胚胎发育、免疫调节等生理过程。病理状态下细胞自噬水平显著升高, 以耐受缺血、饥饿和凋亡等情况。此外, 自噬功能的障碍还会导致某些疾病的发生。根据细胞内底物运送到溶酶体腔的方式不同, 自噬可分为大自噬 (macroautophagy)、小自噬 (microautophagy) 、分子伴侣介导的自噬(chaperon-mediated autophagy, CMA)。此外, 还有些选择性自噬如线粒体自噬 (mitophagy)、聚集体自噬 (aggrephagy)等。不同类型的自噬其发生过程不同,参与的蛋白分子也不同。检测不同自噬过程中的分子标志物的水平、状态与定位有助于评价细胞的自噬水平。
1 大自噬标志物
大自噬的囊泡膜结构起源于内质网和高尔基体等。这些膜片段形成杯状结构, 包裹胞内物质并最终形成闭合的双层膜的囊泡即自噬体, 然后自噬体与溶酶体融合, 自噬体内蛋白质或细胞
器在溶酶体中被溶酶体酶降解。因此该过程的标志物包括自噬体囊泡形成过程的标志物、溶酶体标志物和自噬底物标志物三类。
1.1 自噬体标志物
自噬相关蛋白 (autophagy-related protein, Atg)是一类自噬组成蛋白, 参与调节自噬起始和延伸等过程。其中几个关键蛋白, 也成为自噬标志物。
1.1.1 Atg12-Atg5 复合物Atg12 与Atg5 会形成复合物, 甚至在一些哺乳动物细胞中似乎所有Atg5和Atg12都表现为结合体的形式。Atg12-Atg5 复合物在自噬的形成中至关重要。此外, Atg12-Atg5 复合物还可以充当Atg8-磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine,PE) 结合系统的E3 样连接酶。Atg12-Atg5 的缺失会导致自噬缺陷。但在短时饥饿状态, Atg12-Atg5 的水平改变并不明显。Atg12-Atg5 复合物的水平检测可采用蛋白质印迹技术 (Western blot) 方法进行。Atg12 分子质量预期为15 kDa, 但在SDS-PAGE 胶上目测大约在19 kDa的位置上。Atg5 分子质量大约为32 kDa。由于Atg12分子质量小, 不易检测, 并且Atg5 与Atg12 的结合是非可逆的, 因此可分别用Atg5 和Atg12 的抗体孵育,然后直接检测Atg12-Atg5 的结合形式, 其分子质量大约在55 kDa 左右。
1.1.2 自噬相关16 样蛋白1 (autophagy related 16-like 1, Atg16L1) Atg16L1 与Atg12-Atg5 复合物相互作用, 并以自身寡聚化的方式形成Atg12-Atg5-Atg16L1 复合物 , 附着在自噬体表面, 在自噬前体膜的延伸中发挥作用。在自噬前体膜完全融合形成封闭的自噬体后, Atg12-Atg5-Atg16L1 复合物被释放到胞质中。在细胞膜转移作为自噬膜供体的过程中, Atg16L1 可作为一个指标, 其定位在自噬体上,但在完整的自噬溶酶体膜上尚未见分布。因此,Atg16L1 可以用来检测早期自噬体的形成。可对Atg5、Atg12 或Atg16L1 进行免疫透射电镜和免疫染的检测。检测内源性的Atg5、Atg12 或Atg16L1 所形成的点状聚集或斑块可监测自噬的改变。在生理情况下, 内源性蛋白主要是在胞浆中弥散分布的; 而在饥饿等环境应激下自噬被诱导, 则细胞中Atg5、Atg12 或Atg16L1 的点状聚集或斑块会明显增加。
1.1.3 Atg8/微管相关蛋白1 轻链3 (microtubuleassociatedprotein1 light chain 3, LC3) Atg8/LC3是目前研究中被最广泛使用的分子标志物。在酵母中, Atg8 与PE 偶联形成Atg8-PE[5]。LC3 参与了自噬体膜的形成, 包括两种可相互转化的形式即LC3-I 和LC3-II。细胞内新合成的LC3 经过加工, 成为胞浆可溶形式的LC3-I, 后者经泛素化加工修饰, 与自噬体膜表面的PE 结合, 成为膜结合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬体和自噬体, 是自噬体的标志分子, 随自噬体膜的增多而增加。SDS-PAGE 电泳中, LC3-I 的表观分子质量为18 kDa, LC
3-II 的表观分子质量为16 kDa。尽管PE偶联形式的LC3-II 的分子质量较LC3-I 大, 但是其具有强疏水性, 因此在SDS-PAGE 中电泳迁移率反而比LC3-I (非PE 偶联的LC3) 快。可以通过Western blot比较组间LC3-II 水平, 也可通过计算LC3-II/LC3-I的比值来评价LC3-II 水平, 并推测自噬囊泡数量的多少。LC3 在含SDS 的样品裂解液中易降解, 因此样品经煮沸裂解后应当尽快进行Western blot 实验, 并避免反复冻融。LC3-II 的含量或LC3-II/LC3-I 的比例与自噬体的数量呈正相关, 在某种程度上反映了细胞的自噬活性。但是需要注意的是, 自噬是动态的, 自噬体的聚集可能是自噬活化待降解底物聚集而成, 也可能是自噬效应部分阻断, 自噬体无法被清除导致的。因此仅评价自噬体数量或LC3-II 的表达均不能代表整个自噬过程。只有客观地分析自噬动态变化才能准确地判断自噬活性。基于自噬流 (autophagic flux) 的检测成为反映自噬活性更为可靠的指标。
1.1.4 Atg9/mAtg9 Atg9 是所有Atg 蛋白中唯一的跨膜蛋白, 进化上高度保守, 在酵母以及哺乳动物细胞中都存在。酵母Atg9 存在于30～60 nm 的、来源于高尔基体膜的单层囊泡上, 这些Atg9 囊泡在胞浆快速运动, 并整合到自噬囊泡外膜上。哺乳动物细胞mAtg9 与自噬囊泡存在动态相互作用。在形成成熟自噬体后, mAtg9 并未整合进自噬体囊泡上, 而是又游离进入胞浆。有研究表明, mAtg9 在形成双FYVE 结构域蛋白1 (double FYVE-containing prot
ein 1, DFCP1)阳性的自噬体前体中是必需的, 但不依赖于早期的一些自噬蛋白如UNC-51 样激酶1 (UNC-51-like kinase1, ULK1) 和磷酸肌醇相互作用蛋白2 (WD repeatdomain, phosphoinositide-interacting protein 2,WIPI2)。mAtg9 定位在内体和内体样的部位, 推测其在多种细胞器如再循环的内体间活动, 在自噬的起始进程中发挥极为关键的作用。mAtg9 可用来检测自噬的发生。
1.1.5 Atg6/Beclin1 哺乳动物Beclin1 是酵母Atg6/液泡分选蛋白30 (vacuole protein sorting 30,Vps30) 基因的同源物。Beclin1 主要定位于反面高尔基体 (trans-Golgi network, TGN)、内质网和线粒体。Beclin1 与Vps34 形成III 型磷脂酰肌醇3 激酶复合物 (phosphatidylinositol 3-kinase Class IIIcomplex, PI3KC3) 。Vps34 可磷酸化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI) 生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3-phosphate, PI3P), 而PI3P 募集胞浆中其他自噬相关蛋白Atg 结合到前自噬体膜上, 在自噬体形成早期发挥重要作用。磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K) 抑制剂可干扰自噬体的形成。此外, Bcl-2 与Beclin1 结合也可抑制自噬活性。用荧光显微镜或透射电镜可检测Beclin1-GFP 的点状聚集或斑块作为自噬标志物。但Beclin1 自身有核定位信号, 且GFP 融合蛋白的定位受到GFP 的.干扰, 因此Beclin1-GFP 荧光显微结果显示有核定位倾向, 可能会影响对自噬状态的评判。
在Beclin1 依赖的自噬中, PI3K 活性在自噬体形成中至关重要, 因此在Beclin1 免疫沉淀物中测定PI3K 活性可用来监测其对自噬的调节影响。
1.1.6 Atg14/Barkor Atg14 定位在自噬体上, 其羧基端被命名为BATS (barkor autophagosome targetingsequence) 区域。BATS 区域在Beclin1 招募和自噬活化中意义重大。Atg14 的BATS 区域通过α 螺旋的疏水表面与自噬囊泡膜结合。在应激情况下, BATS 点状聚集或斑块与Atg16 和LC3 以及部分自噬早期标志物DFCP1 重合。Atg14-GFP 或BATS-GFP 在用荧光显微镜或投射电镜技术检测自噬水平时可作为自噬标志物。但除了定位于自噬体, Atg14 也定位于自噬溶酶体和内质网上。因此, 用Atg14 作为标志物时最好也结合用其他自噬标志物做鉴定。
1.1.7 损伤调节自噬蛋白 (damage-regulated autophagymodulator 1, DRAM1) DRAM1 是一个具有六个跨膜结构的疏水蛋白。除了定位于顺面高尔基体, DRAM1 也定位于早期和晚期内体和溶酶体, 它与早期核内体相关蛋白1 (early-endosome-associatedprotein 1, EEA1) 和溶酶体相关膜蛋白2 (lysosomeassociatedmembrane protein type 2, LAMP-2) 共定位。在应激情况下, DRAM1 可被活化的p53 激活。DRAM1 基因沉默会阻断自噬的发生。由于
线形诱导标志
DRAM1分子质量很小, 大约28 kDa, 加之其疏水性强, 蛋白水平检测有一定难度, 可考虑用实时定量PCR 对其mRNA 水平进行检测。
1.1.8 ZFYVE1/DFCP1 锌指FYVE 结构域蛋白1(zinc finger FYVE domain-containing protein 1, ZFYVE1)也被称为双FYVE 结构域蛋白1 (DFCP1), 其羧基端即为两个锌结合的FYVE 结构域。FYVE 结构域参与膜转运和细胞信号, 促进其与含PI3P 的膜结合。ZFYVE1/DFCP1 与PI3P 结合后, 定位于内质网和高尔基体。饥饿诱导DFCP1 转位至粗面内质网的粗粒上, 显示在欧米茄体 (omegasome) 形成的部位。因此DFCP1 可作为自噬形成初期的标志物。DFCP1的表达可用荧光免疫组化方法观察, 出现DFCP1 阳性的点状分布则意味着自噬囊泡正在开始形成期。