Microbiome：肠易激综合征的认知行为疗法诱导与胃肠道症状改善相关的脑-肠-微
生物组轴的改变
人们越来越认识到，消化道和大脑之间的信号传导通路是引起肠易激综合征（IBS）的原因。最近的一项随
机对照试验表明，认知行为疗法（CBT）可改善IBS症状。本次研究调查了脑-肠道-微生物轴指标是否可以预测
CBT预后，以及是否与脑-肠-微生物轴（BGM）的变化相关。本文发表在Microbiome杂志。
Gut：脑成像技术在脑肠交互疾病中的角
方法
接受CBT的84名III级IBS患者（IBSOS，NCT00738920）进行基线和后的多模态脑成像和心理评估。
对基线和后的34名CBT被试收集粪便样本，进行16S rRNA基因测序，非靶向代谢组学和短链脂肪酸含量的
测量。通过多元线性模型鉴定了与CBT反应相关的临床指标，脑功能连接和微观结构以及微生物组特征。
结果
在基线时，与对照组相比，接受CBT的患者粪便血清素水平增加，梭状芽胞杆菌增加，拟杆菌减少。
包含11个微生物属的随机森林分类预测CBT病症（ROC=0.96）。后，接受CBT的患者在感觉运动，脑
干，突显网络和默认模式网络的脑区间显示出功能连接降低，以及基底神经节和其他白质结构的变化。大脑
差异与微生物组的变化相关，包括拟杆菌属的增加。
结论
前的肠道微生物和血清素水平与CBT反应相关，这表明来自微生物的外周信号可以调节受CBT
影响的中枢过程，从而产生腹部症状。CBT反应的特征在于大脑网络和肠道微生物组的相关变化，这可能反映
了CBT大脑对微生物组的自上而下的影响。
关键词：认知行为疗法，肠易激综合征，脑-肠道-微生物组轴，神经影像学，生物标志物，结果预测
介绍
肠易激综合征（IBS）是一种常见的脑肠道互作疾病，在没有任何胃肠道结构、炎症、免疫或生化病理学的
情况下，与改变排便习惯相关的复发性腹痛。由于缺乏对IBS进行分类的可靠生物标志物，通常通过患者报告
评估症状改善和效果。
人们越来越认识到脑-肠道-微生物组轴（BGM）的相互作用在调节胃肠道功能、症状、情绪和情感方面的
重要作用，这标志着它成为IBS干预的靶点。大量证据支持IBS患者脑网络中存在解剖学和功能连接改变，
这些改变与情绪、突显网络、感觉运动网络和脑干功能有关。此外，一些研究已经报告了患者亚中微生物
分类相对丰度的改变，包括一项研究表明特定肠道微生物改变与感觉相关脑区灰质体积显著差异相关。
认知行为疗法（CBT）是一种有效的脑靶向干预，可解决已知会加重腹部症状的心理因素，包括适应不
良、强烈担忧，应激反应和对威胁的高度警惕。最近的一项大型随机临床试验结果表明，与接受非特异性治
疗的IBS患者相比，与IBS相关的两种CBT可有效改善持续的胃肠道症状。在某种程度上，CBT通过生物信号
途径诱导症状改善，假设这主要通过调节BGM（脑-肠道-微生物组）轴的大脑部分，但这些变化对BGM轴的其
余部分和症状改善的影响尚不清楚。进一步假设，以神经活性代谢物（包括短链脂肪酸和5-羟胺）的形式向
大脑发出的信号可以调节对CBT的预后。
我们前瞻性地从随机，对照，平行的CBT试验（肠易激综合征研究）中招募了84名IBS患者，并评估了CBT
基线和2周后的大脑静息状态功能连接和微观结构。选择其中34名CBT被试中分析了肠道微生物组的组成
和功能。通过评估肠道微生物的相对丰度和功能，多模态脑成像和详细的临床测量，我们旨在验证两个主
要假设：
（1）基线脑和/或微生物组参数是否预测预后？
（2）对CBT的成功预后是否与大脑和微生物组的改变有关？
方法
被试者
本研究的数据来自IBSOS研究中招募的IBS受试者（n = 436），CBTIBS症状改善相关的生物学机制，其结果先前已发表。详细的纳入和排除标准已经公布。简而言之，18至70岁之间根据Rome III标准诊断为IBS的症状评为"中度严重"（即每周至少发生两次并造成生活影响）。如果患者患有另一种原发性胃肠道疾病，过去5年的恶性肿瘤，主要的精神共病，正在接受IBS靶向心理，无法承诺完成所有预定的就诊，在评估前2周内报告胃肠道感染，或在研究前12周内使用肠道敏感抗生素，则患者将被排除在外。84名受试者接受了神经影像学检查和详细的临床评估，34名受试者接受了微生物组测量和膳食摄入量的评估（饮食史问卷II）。这些受试者数量除了纳入/排除标准之外，没有应用任何筛选标准。
程序
如前所述，符合条件的患者被随机分配接受10次临床CBT或4次基于家庭的CBT，在10周的急性期中师接触最少。10次CBT每周一次，持续10周，而4次家庭CBT在第1周、第3周、第5周和第10周进行。对于这些分析，两种CBT方案被合并，因为它们包括相同的程序（患者教育，自我监测，肌肉放松，忧虑控制，灵活解决，复发预防），并且已被证明具有疗效等效。
临床措施
在前基线和CBT完成后2周获得临床测量。延迟2周旨在减少相关过程的影响，例如与师的关系和对改善的期望。在更大规模的研究中使用的措施细节已经发表过。IBS症状严重程度量表（IBS-SSS）用于测量症状严重程度，包括疼痛，腹胀，肠功能障碍和生活质量/整体幸福感。临床改善的阈值设定为量表评分降低50分或更高。符合此标准的参与者被归类为响应者。其他临床指标包括自我评分，疼痛，压力感知和情绪。
磁共振成像
所有被试使用3T Siemens Prisma MRI扫描仪（德国埃尔兰根西门子）接受了基线和后成像，以进行高分辨率T1结构扫描，静息状态功能扫描和扩散张量成像扫描。
神经影像学数据的统计分析
在有效组和无效组中分别测量静息状态功能连接的基线差异和CBT后的改变。在基线和CBT后的平均165×165连接矩阵使用CONN中的一般线性模型（GLM）对年龄和性别的配对T检验。显著性设定为α=0.05，并且所有检验均使用Benjamini-Hochberg方法进行校正。在 Linux 中使用 circos 0.69进行可视化。
在白质和皮质下结构（包括基底节、丘脑和脑干）中，分别评估了对CBT有反应和无反应的受试者在
基线和前的扩散张量成像（DTI）参数变化之间的体素相关性。统计参数使用SPM的GLM生成，该GLM考虑了年龄和性别作为协变量。该模型涉及量化了CBT有效者和无效者前后指标各向异性（FA）或表观扩散系数（ADC）变化的差异。GLM是使用AFNI（afni.v）实现的。对于每个感兴趣团块的对比，所得的结果在显著性p<0.05的水平作为阈值，并且团块大小阈值大于250。这个最小团块大小类似于以前使用基于团块大小的排序校正的研究，同时也最大限度地提高对DTI变化统计的敏感性。
粪便16S rRNA基因测序
在基线和结束后2周内从该被试中挑选34名患者获取了新鲜的冷冻粪便样本。为被试提供家用粪便收集套件，并要求在收集后立即将粪便样本储存在冰箱中，直到收集后24-48小时内由快递服务人员取走，储存在-80°C冷冻的粪便样品后来在液氮下用研钵和研杵研磨成粗粉。根据已发表的实验方案，通过磁珠提取DNA 和扩增16S rRNA的V4区域。该文库在Illumina HiSeq 2500上进行了2×250次测序，每个样本的平均深度为107433个合并序列。QIIME 1.9.1用于样本的质量过滤，将配对的末端读取和聚类序列合并为97%的分类单元。分类是使用2013年5月Greengenes数据库分类器。使用Chao1丰富度指数，Faith系统发育多样性和Shannon指数均匀度评估微生物组α多样性。通过加权UniFrac距离比较样品中的微生物组组成，并使用主坐标分析可视化。使用具有100000个排列的多变量Adonis评估微生物组成差异的重要性。使用在DESeq2中实现的多变量混合模型确定两组间基线微生物属的差异丰度，
该模型具有排便习惯和性别作为协变量。纵向Adonis和DESeq2模型比较了前后的差异，包括被试标识符作为协变量。
粪便代谢组学
粪便等份被运送到Metabolon Inc.，并在其HD4代谢组学分析平台上作为单个批次运行。通过将频谱特征与
Metabolon的专有库来鉴定化合物，该库包括3300多种纯化标准品的MS / MS频谱数据。结果得到872种已知化合物的估算丰度。粪便等份样本还进行了靶向LC-MS / MS分析，以测量九种短链脂肪酸的浓度。比较被试之间的代谢组学概况，并使用Jensen-Shannon发散非度量方法进行可视化。CBT有效组和无效组之间差异是由Adonis确定，将排便习惯和性别作为协变量。通过非参数 Mann–Whitney U检验评估 CBT 有效组与无效组之间短链脂肪酸、5-羟胺、多巴胺和组胺组分在基线时或 CBT 前后值之间的统计学意义。使用排便习惯和性别作为协变量的GLM对整个数据集的差异丰度检验并将数据进行对数转换。使用在limma R包中实现的经验贝叶斯慢化T检验计算显著性。参与者标识符在limma分析中用作协变量。
随机森林分类器
为了确定基线微生物组，临床或大脑数据预测CBT反应（有效组/无效组）的程度，使用R包进行了具有5倍交叉验证的随机森林分类。通过计算ROC曲线下的面积来确定所得分类器的精度。每个变量对分类器准确性的贡献通过变量重要性分数评估，在R包pROC 中使用ROC检验评估了分类器的准确性。
微生物组变化与大脑变化和临床变化的相关性
与无效组相比，控制年龄和性别的部分相关性在CBT有效组的显著脑变化和微生物组或临床变化之间运行。使用Benjamini-Hochberg FDR方法对统计结果P值进行多重检验校正，并报告了有显著差异的q值。
结果
在接受神经影像学检查的84名IBS被试中，58名（69%）被归类为CBT有效组，而26名（31%）被归类为非应答者，基于后IBS症状严重程度量表50分或更高。比较CBT应答者和非应答者的基线临床和脑-肠-微生物组参数，以确定是否可以预测结果。
CBT有效组在基线时具有不同的微生物组特征
临床措施
在接受神经影像学检查的84名受试者中，在前基线时，有效组和无效组之间的任何临床指标均无差异（表S1）。
大脑功能连接
与无效组相比，组中枢自主神经网络（右眶下沟）和情绪调节网络（右下额沟）之间的基线连接显著上升（q=.02）。
白质完整性
在调整为多个假设检验后，CBT应答者与非应答者之间在基线分数各向异性（FA）或表观扩散系数（ADC）方面没有观察到统计学上的显著差异。
微生物组
34名受试者的亚组通过16S rRNA基因测序进行粪便采样以进行微生物组分析。这包括22名CBT有效者（65%）和12名无效者（35%），他们通过临床测量或布里斯托尔粪便量表评估没有差异（表S2）。微生物α多样性、均匀度和系统发育多样性在有效组和无效组之间没有显著差异，而β多样性分析显示，有效组有显著差异（p=.016）（图1, 5A）。与无效组相比，有效组的Roseburia、Lachnobacterium和未分类的Lachnospiraceae（所有梭状芽胞杆菌目的成员）较高，拟杆菌、副拟杆
菌和Prevotella（所有拟杆菌目的成员）减少了。梭状芽胞杆菌与拟杆菌（在无效组中显著富集的主要属）之间的反比关系在主成分分析显著，其中梭状芽胞杆菌/拟杆菌将基线样品分开（图1A, B）。IBS-SSS定义的症状严重程度与微生物多样性或组成没有显著相关性。
图 1基线粪便微生物和血清素与 CBT 反应相关。
A,B、16S rRNA测序数据进行主成分分析（PCA）。每个点代表一个IBS被试的基线微生物组成。颜表示CBT被试类别，点的大小由拟杆菌属（A）或梭状芽胞杆菌目（B）组成。
C、显示与 CBT 有效组具有统计学意义（q<.05）相关性的微生物属。y轴显示有效组与无效组之间倍数变化的 log2值。点大小与所有样品的平均相对丰度成正比。
D、神经递质血清素、多巴胺和组胺在粪便中的相对丰度（中位数）。线条表示中位数。*p<.05由 Mann–Whitney U检验。
E、代谢组学进行多维尺度分析（NMDS）。颜表示 CBT 被试状态。由阿多尼斯检验计
算P值，根据性别和排便习惯亚型作为协变量进行调整。
代谢组学
对34名受试者进行粪便代谢组学分析，以研究与CBT反应相关的基线微生物的功能特征。由于Roseburia 菌（已知是丁酸盐等短链脂肪酸的来源）在有效组中显著富集，我们测量了粪便中短链脂肪酸浓度。CBT有效组与无效组在9种短链脂肪酸中未观察到显著差异（图S2）。然后评估微生物组产生的神经递质的丰度，如血清素，去甲肾上腺素，GABA，多巴胺和组胺。其中，与无效组相比，有效组的粪便血清素水平升高
（p=.03）（图1C）。有效组与无效组之间去甲肾上腺素和GABA，多巴胺或组胺无差异。将分析扩展到其他粪便代谢物，CBT有效组和无效组之间的代谢组学特征没有显著差异（图1D）。差异丰度测试在纠正多个假设检验后，没有发现任何与CBT反应有统计学意义的代谢物，尽管55个代谢物名义上显著（表S3）。
饮食
我们使用食物频率问卷评估了34名接受粪便采样的被试的基线膳食摄入量。与无效者相比，CBT有效者的碳水化合物摄入量较低，总脂肪和单不饱和脂肪摄入量较高，纤维摄入量较高。
用于预测 CBT 预后的分类器
随机森林分类器是根据基线临床数据、脑影像特征或微生物分类创建的，并通过5倍交叉验证进行评
估。其中，只有微生物组结果构建的分类器具有很高的准确性来预测CBT预后（AUROC 0.96）。相比之下，根据人口统计学特征和临床指标构建的分类器具有AUROC为0.57。使用静息态功能连接，FA或ADC构建的分类器的AUROC分别为0.66，0.51和0.49，当所有指标数据合并时，所得分类器的AUROC为0.67。通过bootstrap分析，微生物组分类器准确性的提高非常显著（p=6×10−5和p=.0001分别与临床/人口统计学和组合分类器进行比较，临床/人口统计学和脑分类器之间没有显著差异）（图2A）。对微生物组分类器准确性贡献最大的分类是：未分类的红斑藻科、未分类的拉氏菌科和拟杆菌科（图2B）。
图 2 从粪便微生物谱中提取的分类器预测CBT预后优于基于临床/人口统计学和神经影像学数据的分类器。根据差异显著的微生物属、基线临床/人口统计数据（左图）或脑数据（右图）构建的CBT预后的随机森林分类器的接收者操作特征曲线。95%置信区间表示为这些曲线周围的彩区域（蓝=微生物组，红=临床/人口统计学或脑影像）。
B，随机森林分类器中11个微生物属的重要性排序。
有效组在CBT后拟杆菌上调和脑影像明显变化
比较了有效者和无效者之间临床神经影像学和微生物组成在后的变化，以表征CBT对有效者脑-肠-微生物轴的差异作用。
CBT后的临床变化
后，在具有神经影像学数据的84名受试者中，有效者的腹痛（Gracely，p = 1×10−6），IBS症状强度（优雅，p= 4×10−10），负面情绪评级（POMS，p= .002）和感知压力（PSS，p = 1×10−5）与无效者（表S5）相比显著降低。此外，有效组的IBS自我评分（p=2×10−14）和积极的情绪评级（p=.0001）显著提高。
CBT后大脑功能连接改变
CBT后，有效组显示出与特定大脑网络相关的多个脑区之间的连接性降低，包括感觉运动，默认模式，突显网络和情绪调节网络（表1，图3）。他们还表现出与脑干和默认模式以及感觉运动网络相关的区域之间的连接性降低（所有q<.05）。无效者显示两个脑区之间的连接降低，一个在后扣带回内（默认模式网
络，q=.047），另一个在中额叶回（中央执行网络）与枕下回和沟（枕叶，q=.047）之间。对于任何接受CBT 的人来说，没有观察到连接显著增加。
表1 响应者和非响应者中静息状态功能连接的 CBT 相关变化
图 3 CBT后有效者和无效者的功能连接变化。
A、连接图显示了 CBT 有效者和无效者的连接差异。脑区间连接显著减少的区域由蓝线表示（颜强度表示效应的大小）。
SMN：感觉运动网络，BG：基底神经节，DMN：默认模式网络，SAL：突显网络，ERN：情绪调节网
络，CAN：中央自主神经网络，CEN：中央执行网络，OCC：枕叶视觉网络。
B、在 CBT 的有效组和无效组之间差异显著的脑区。
CBT有效组：ACirIns（岛叶前叶/岛叶环沟前段），MPosCgG / S（前扣带回皮层），InfCirIns（前岛叶/岛叶环沟下段），SupTGLp（上颞回的外侧），HG，TPI（平面颞叶），BSt（脑干）。CBT 无效者：MFG（中额回）、PosDCgG（背后扣带皮层）、PosVCgG（腹侧后扣带皮层）、InfOcG/S（枕下回沟）
CBT后白质完整性变化
在左下纵束内的CBT无效组中观察到FA的显著上调（图4A）。此外还观察到CBT有效组在包括基底神经节和丘脑前部的区域内双侧ADC（图4B）以及胼胝体（图4C）显著升高。
图 4 CBT有效组的白质完整性有明显的变化。
A、彩区域表示左下纵束内在 CBT后FA发生显著变化的区域。颜对应于 CBT 有效者和无效者之间 FA 变化的相对差异。
B,C、彩区域表示CBT后双侧基底节和丘脑前部（B）和胼胝体（C）脑区的ADC有显著变化。颜对应于CBT 有效者和无效者之间ADC的相对差异。
CBT后在微生物组和代谢组的差异
CBT后，34例接受粪便抽样的受试者中，有效者后的菌丰富度和系统发育多样性显著下降，而无效者后微生物多样性没有变化（图5A）。有效者还表现出微生物组成的显著变化（p= 2×10−5），而无效者在微生物组成方面没有总体变化（图5B）。差异丰度结果显示，CBT后有5个属在有效者中富集，包括拟杆菌、Odoribacter、副拟杆菌、厌氧菌和未分类的S24-7（图5C）。其中，拟杆菌是最富集的，变化幅度最大（增加2.5倍，q= 4×10−5），导致许多患者在结束时转化为以拟杆菌为主的微生物（图5B）。两组的基线和后之间的代谢组学指标没有差异，并且进行多重假设检验校正，后CBT有效者中没有发现代谢物或短链脂肪酸的丰度有显著差异（表S7，图S2）。
图5 CBT后改变了肠道微生物的组成
A、CBT应答者和无应答者（NR）在基线检查（前）和CBT后的粪便微生物α多样性。使用了三个指标：Chao1指数（丰富度）、Faith’s系统发育多样性（PD）和香农指数（丰富度和均匀度）。*p<0.05。
B、主坐标分析CBT前后的16S rRNA序列数据，按CBT反应状态分层。每个点代表一个样本，按时间点（红=基线，蓝=后CBT）着，并按类杆菌丰度确定大小。箭头连接来自同一参与者的样本，箭头指示后处理。Adonis计算的P值，根据参与者进行调整。
C、图中显示了与CBT应答者状态（q<0.05）有统计学显著关联的微生物属。y轴显示响应者与非响应者之间折叠变化的log2。点大小与所有样本的平均相对丰度成正比。
线形诱导标志CBT 后的饮食和粪便稠度指标
在接受微生物组分析的34名受试者中，CBT应答者在完成CBT完成后2周通过饮食问卷评估，在膳食常量营养素含量或特定食物和营养素的摄入量方面没有任何显著变化（表S8）。布里斯托尔粪便量表评估的两组的粪便稠度没有显著变化（图S3）。
CBT有效者大脑影像指标的变化与临床量表相关
CBT后静息状态功能连接性改变与DTI指标和有效者临床指标的相关
在有效者中，突显网络关键节点（右前扣带中皮层和左前岛叶）之间的连接性降低与较高的阳性情绪评级相关（POMS，r(49)=.29，q=.036）。脑干和左颞上回之间的连接减少与较高的积极情绪（POMS，r(49)=.36，q =.036）和较低的负面情绪（POMS，r(49)=−.32，q=.042）相关。右前INS和右颞上回之间的连接减少与腹痛评分较低有关
（Gracely，r(49)=−.33，q=.036）。
白质完整性指标中（表2）
有效者与CBT相关的下纵束FA值的降低与积极情绪的增加显著相关（PANAS，阳性，q=0.040），脑干ADC 越高，积极情绪得分越高（POMS，q=0.040）。
CBT诱导的大脑变化与微生物组相关
大脑功能连接
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