2022乙肝病毒标志物在临床实践中的应用（全文）
乙型肝炎病毒（HBV）具有独特的生命周期（图1），且易整合到宿主基因组中，这使得研究人员及临床工作者难以分析慢性乙型肝炎的自然病程，预测和评估抗HBV药物疗效以及确定终点。目前学界主要研究的乙肝病毒标志物包括：松弛环状DNA（rcDNA）、共价闭合环状DNA（cccDNA）、HBV RNA、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）、乙型肝炎病毒核心相关抗原（HBcrAg）。
图1 HBV复制周期示意图（Ou Q， et al. 2020）
注：HBV脱壳进入肝细胞后，释放rcDNA入细胞核。rcDNA以双链线性DNA（dslDNA）的形式还原为cccDNA或整合到宿主基因组DNA中。cccDNA经转录合成病毒RNA。前基因组RNA翻译合成HBcAg和聚合酶，然后组装成pgRNA颗粒。pgRNA逆转录合成rcDNA。子代rcDNA核循环完成细胞内cccDNA扩增。PreS1和PreS2/S区编码HBsAg，HBsAg也来自整合的HBV DNA。干扰素影响cccDNA的表观遗传学，下调cccDNA活性，而NAs竞争性地抑制逆转录蛋白，阻断pgRNA逆转录合成rcDNA。
cccDNA=共价闭合环状DNA；ER=内质网；HBc=HBV核心蛋白；MVB=多泡小体；pgRNA=前基因组RNA；Pol=聚合酶；rcDNA=松弛环状DNA；ssDNA=单链DNA。
本文将主要论述上述标志物在预测慢性乙型肝炎活动性和监测应答中的意义，并在此基础上提出了一些实验室诊断中应注意的问题。
01、HBV cccDNA
HBV cccDNA在肝细胞核中呈游离状态，当肝细胞受损时可能出现在血清中。其是唯一的
转录模板，指导所有HBV产物的表达并保持乙肝病毒的复制。cccDNA的数量和转录活性对于评估疾病活动性和应答非常重要。在肝细胞核中，由于cccDNA很难被消除，且新的肝细胞可被持续感染，cccDNA池是高度稳定的。在免疫系统不完善且没有药物的情况下，少量cccDNA可能导致大量肝细胞感染HBV或慢性乙型肝炎复发。目前认为，消除或永久沉默cccDNA是慢乙肝长期的最佳策略。
cccDNA位于受感染肝细胞的细胞核中，肝活检是观察其特征的最佳方式。但这种侵入性操作不易被患者接受，并且组织提取物不能代表整个肝脏。自20世纪90年代以来，有多种方法已被用于检测HBV cccDNA，如巢式RT-PCR、嵌合引物RT-PCR（chimeric primer RT-PCR）、侵染检测等。但到目前为止，还未开发出获得广泛认可的HBV cccDNA精确定量方法或商业试剂盒。因此，寻新的血清标志物来间接反映cccDNA的转录活性，探索更有效的cccDNA检测方法非常重要。
02、HBV RNA
血清HBV RNA是前基因组RNA（pgRNA）释放至细胞外的产物，大小为3.5kb。HBV RNA是HBV DNA负链的逆转录模板。
血清HBV DNA和HBV RNA与慢性HBV感染初治患者的cccDNA显著相关。初治患者血清中HBV RNA约为106 拷贝/mL，HBV DNA约为109拷贝/mL。核苷（酸）类似物（NAs）可抑制HBV DNA的逆转录，故相较于聚乙二醇干扰素α（PegIFNα），经NA后的患者HBV DNA下降更快。相反，NAs不会阻断HBV DNA转录成HBV RNA，因此，随着的持续HBV RNA/HBV DNA的比例可能会增加。当HBV DNA低于检测下限时，可能无法评估cccDNA的状态。在这种情况下，HBV RNA检测可能更有意义，更有利于抗病毒疗效的动态监测。
van Bömmel等人提出，全长型和顿挫型HBV RNA水平的下降可预测在NAs第12周（AUC分别为0.9和0.9）和第24周（AUC分别为0.8和0.85）时的HBeAg血清转换。Wang等人证明了NAs停药时血清HBV RNA阳性与病毒再激活的风险有关。
线形诱导标志针对HBV RNA的持续检测不到，Lu等人提出了“前瞻性临床治愈”的概念。他们认为，HBV DNA和HBV RNA同时低于检测限或可作为停止NAs的一个指标。
Wang等人报道，在恩替卡韦后达到病毒学应答的患者中，血清HBV RNA水平与肝内cccDNA水平无相关性，但血清HBV RNA与肝内HBV RNA及肝内HBV RNA/cccDNA比值
相关。HBV RNA来源于cccDNA的转录，说明HBV RNA可能反映了cccDNA的转录活性。
经PegIFNα后HBV RNA的下降幅度明显大于NAs，而PegIFNα后获得应答的患者其HBV RNA下降幅度明显大于未应答患者。
Giersch等人曾报道，PegIFNα期间血清HBV RNA和肝内cccDNA之间没有定量关系期间。但van Bömmel等人曾证明，HBV RNA的cut-off值＞5.5 log10拷贝/ml可鉴别30%的PegIFNα12周时的无应答患者（阴性预测值为90%）。在这种情况下，HBV RNA或可作为预测PegIFNα疗效的指标。
cccDNA水平不一定与cccDNA的生物学活性一致，因此，虽然HBV RNA与cccDNA水平无相关性，但HBV RNA仍可能反映了cccDNA的活性。
03乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）
HBV编码大（LHBsAg）、中（MHBsAg）、小（SHBsAg）三种HBsAg蛋白；这些蛋白质构成了病毒的外壳。除了完整的病毒颗粒之外，过量的HBV表面蛋白可以组成非感染性亚病毒颗粒（SVP）（图2）。
图2 亚病毒颗粒（subviral particles）、完整病毒颗粒（complete virions）和HBcrAg的成分（Ou Q， et al. 2020）
虽然SVP浓度大小（1013 IU/mL）是Dane颗粒（109 IU/mL）的1万倍，但常规检测尚不能明确HBsAg来自于哪种颗粒。
初治CHB患者的血清HBsAg与肝内cccDNA呈正相关。PegIFNα期间，血清HBsAg的动态下降可提示持续的病毒学应答。