越来越多的证据表明肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和外泌体在转移前niche（生态位）形成中发挥重要作用。TAMs是转移前生态位形成和结直肠癌肝转移(CRLM)的基础。然而，肿瘤来源的外泌体miRNAs与TAMs相互作用的分子机制仍然很大程度上未知。本研究发现肿瘤来源外泌体miR-934可以诱导巨噬细胞M2极化，进而促进CRC的肝转移。该文于2020年11月发表在《Journal of Hematology and Oncology》IF：11.059期刊上。
技术路线
主要实验结果1、miR-934表达升高与CRLM进展及预后不良呈正相关为了揭示参与CRLM的miRNA，作者基于TCGA数据库比较了CRC的1期肿瘤和4期肿瘤的miRNA表达谱，发现miR-934是在4期肿瘤中高表达差异表达最显著的miRNA（Fig. 1a,b）。此外，作者将110个CRC组织按有无肝转移分为两组，发现肝转移组与未转移组相比，组织和血清miR-934表达上调（Fig.1c, d）。接下来，为了研究miR-934在CRLM进展中的作用，使用ISH比较了miR-934在包含308个CRC样本的组织芯片(TMA)中的表达，与正常粘膜组织相比，CRC组织中miR-934的表达明显上调;miR-934表达增加与T分期、M分期、晚期AJCC分期和肿瘤复发呈正相关，尤其是在肝转移的病例中（Fig. 1e）。以上数据提示，miR-934异常高表达与结直肠癌肿瘤进展及肝转移显著相关。生存分析显示，与miR-934表达较低的患者相比，miR-934表达较高的患者总生存期(OS)和无病生存期(DFS)较低（Fig. 1f, g）。因此，在CRLM患者中，miR-934高表达与CRLM进展和预后不良呈正相关。
图1 miR-934表达升高与CRLM进展及预后不良呈正相关2、miR-934存在于CRC细胞衍生的外泌体中miR-934在HCT-8和LoVo的CM中的表达显著高于其它细胞（Fig. 2a）。随后，研究发现HCT-8和LoVo的CM中miR-934的表达显著高于细胞核和细胞质（Fig. 2b, c）。并且，miR-934在CM中的表达不随RNase A的处理而改变，而随RNase A Triton X-100的处理显著下降（Fig. 2d），这表明细胞外的miR-934被膜包裹，而不是直接分泌。因此，推测miR-934可能是被外泌体传输。电镜和纳米颗粒追踪分析表明，miR-934表达水平较高的CRC细胞分泌的外泌体比miR-934表达水平较低的CRC细胞分泌的外泌体更多（Fig. 2e, f）。各组外泌体标志物CD9，ALIX，TSG101均被WB检测到（Fig. 2g）。为了阐明miR-934是否主要来源于CRC细胞的外泌体，使用GW4869抑制CRC细胞的外泌体分泌，发现miR-934在CRC细胞来源的外泌体中的表达水平明显高于外泌体耗尽的CRC细胞（Fig. 2h）。此外，采用qPCR分析miR-934在总CM、外泌体耗尽CM(超离心耗竭)和外泌体中的表达，结果显示，miR-934在总CM或外泌体中的表达显著高于外泌体缺失的CM（Fig. 2i）。此外，使用qPCR研究了上述四种CRC细胞系的外泌体中miR-934的表达，发现外泌体中miR-934的表达模式与CRC细胞CM中的表达模式一致（Fig. 2j）。以上结果表明miR-934主要包裹在CRC细胞来源的外泌体中。
图2 miR-934存在于CRC细胞衍生的外泌体中3、CRC细胞来源的外泌体miR-934诱导巨噬细胞M2极化为了探索miR-934促进CRLM的分子和细胞基础，通过Cytoscape软件注释了TCGA cohort中191个miR-934相关基因的细胞功能，发现miR-934广泛参与多种炎症反应，提示miR-934可能参与了CRC免疫微环境（Fig. 3a）。然后发现miR-934与巨噬细胞
的基因信号特异性相关（Fig. 3b）。为了研究在CRLM中TAM的浸润与miR-934之间的相关性，我们在原发性结直肠癌组织和CRLM组织样本中采用免疫组化染检测TAM标记CD163。如图3c所示，在CRLM组织中CD163 TAM浸润丰富的区域观察到miR-934表达升高。将THP-1细胞与PMA孵育，诱导分化为M0巨噬细胞，M0巨噬细胞具有适当的贴壁形态和巨噬细胞标志物CD68的高表达（Fig. 3d）。接下来，研究了CRC细胞来源的外泌体对巨噬细胞M2极化的影响。如Fig. 3e所示，当与巨噬细胞共培养时，标记有DiO(绿)的CRC细胞来源的外泌体被未染的巨噬细胞内化。相比于低表达miR-934的细胞的外泌体孵育的巨噬细胞或PBS孵育的细胞，M2标记物 (CD206, arginase-1, IL10和CD163)的表达在高表达miR-934的CRC细胞的外泌体孵育的巨噬细胞中显著增加，而M1标记物(iNOS和IL-1β)几乎无差异（Fig. 3f, g）。为了确定CRC细胞来源的外泌体miR-934是否诱导巨噬细胞的M2极化，首先生成了miR-934 mimics和anti-miR-934来过表达或抑制miR-934的表达。与对照组相比，转染miR-934 mimics的巨噬细胞M2标记物(CD163、CD206、arginase-1和IL10)的表达明显增加（Fig. 3h, i）。此外，用anti-miR-934、miR-934 mimics或其阴性对照载体转染HCT-8和HT29细胞，提取其外泌体并添加到PMA处理的THP-1细胞中。结果显示，转染anti-miR-934或miR-934 mimics的CRC细胞的外泌体中M2
标记物(CD206、arginase-1、IL10和CD163)在PMA处理的THP-1细胞中表达明显低于或高于载体对照组（Fig. 3j, k）。综上所述，证实CRC细胞来源的外泌体miR-934可以诱导巨噬细胞M2极化。线形诱导标志
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