细胞凋亡又叫程序性细胞死亡,是细胞在一系列内源性基因的调控下发生的自然或生理性死亡的过程。细胞凋亡过程是受基因的精确调控而完成的,其具体的过程机制尚不明确,Bcl-2 是一种细胞膜蛋白,主要存在于线粒体膜、滑面内质网和核膜上,高水平的 Bcl-2 蛋白有抑制细胞死亡等作用,是细胞凋亡调控机制中的一个关键蛋白。Tanaka等证实 Bcl-2 能抑制睾丸生精细胞的凋亡和分化。CytC 是一个线粒体起源的细胞凋亡信号,Bcl-2可通过抑制CytC从线粒体的释放入细胞质,而Bax、Bak可与Bcl-2结合,止其对CytC释放孔道的抑制作用,从而促进CytC从线粒体释放,引起凋亡。CytC通过接头分子使caspase（胱冬肽酶）分子募集并相互酶解活化,进而诱导细胞凋亡。caspase-3是介导细胞凋亡的关键效应酶,是凋亡执行的重要效应分子。正常情况下,caspase-3以酶原的形式存在于细胞质中,无活性,当细胞接受凋亡刺激时,其被激活,而诱导凋亡。caspase-3是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点,它的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志。
检测生精细胞凋亡的技术
4．1 形态学检测
透射电镜检测：处死大鼠,取出睾丸。取出左侧睾丸少量组织,迅速在冰浴上切成1mm×1mm×2mm小块,置于预冷的2%戊二醛溶液中固定,标本经锇酸固定、脱水、树脂包埋、超薄切片和醋酸双氧铀染后,在透射电镜下观察。可见细胞质空泡化,核膜增厚,核周隙增宽；染质浓缩,附着于核边缘呈新月形；严重者染质固缩、断裂, 出现凋亡小体。
4．2 琼脂糖凝胶电泳
通过观察 DNA梯状电泳带或定量检测DNA片段,可测定凋亡。凋亡细胞 DNA 在核小体连接处规律性降解,形成以180 bp一200 bp为最小单位的寡聚体片段,琼脂糖凝胶电泳时呈典型的“梯状带”。但Singh等琼脂糖凝胶电泳检测到青年人生精细胞DNA迁移呈圆形,老年人凋亡生精细胞DNA迁移呈彗星状 。
4．3 DNA缺口原位标记法
处死大鼠,取出睾丸。置于10%中性福尔马林溶液中固定24ｈ,常规石蜡包埋、切片（4μm）,用于原位末端标记法（TUNEL）检测。主要以精原细胞凋亡为主。可见曲细精小管中各级生精细胞大量凋亡,管腔变薄,管腔中可见大量凋亡的分裂晚期的精子细胞。DNA缺
口原位标记(TUNEL)法可用于检测凋亡细胞。此方法是将细胞的外源性核苷酸 (dUTP)结合到单股断链的3′粘性未端上,标记的DNA 再用荧光或显法检出。该法可检测早期细胞凋亡,特异性和敏感性都很高。E renpreisa等用甲苯胺蓝(tolui di ne blue,TB)、吖啶橙 (acridine orange,A0)和TUNEL法检测人生精细胞 DNA的完整性,证实这3种方法具有一致性。
4．4 流式细胞术
流式细胞 (flow cytometry, FCM)可进DNA 、RNA含量分析,细胞周期、细胞表面标志和细胞受体分析。凋亡细胞的DNA裂解,FCM的DNA图上呈亚二倍体核型峰特点。应用DNA 染剂穿透正常和凋亡细胞膜的能力,及其与凋亡细胞DNA 结合能力不同以区分正常细胞、凋亡细胞。FCM 还可定量检测凋亡标记蛋白的表达。吞噬凋亡细胞和未吞噬凋亡细胞的巨噬细胞可利用带有荧光染料反应物的FCM 区分。
4． 5 免疫组化法
线形诱导标志利用抗原抗体特异性结合测定凋亡相关物质以检测凋亡。凋亡蛋白抗体或抗单链 DNA 抗体标记观察凋亡细胞可检测凋亡标记蛋白Fas／FasL、Bc1-2／Bax、p53、p2l、caspases等以鉴定细胞凋亡。
死亡受体途径
Fas/FasL系统：现已有多种证据表明Fas/FasL信号系统启动生精细胞的凋亡：①在混合培养的支持细胞和生精细胞中加入FasL的反义核苷酸(阻断FasL的翻译), 能明显观察到生精细胞凋亡数目的减少；②Fas和Fas L的mRNA表达量随动物年龄的不同而不同。大鼠在16~ 33 d最多, 此时刚好是大鼠生精细胞凋亡的高峰期；③加入模拟 FasL效用的 Fas激动剂Jo-2(一种抗 Fas的抗体), 生精细胞的数目大大减少；④在环境内分泌干扰物邻苯二甲酸-2-乙基已基酯(DEHP)的代谢产物邻苯二甲酸-单-乙基已基酯(MEHP)等一些有害化合物引起的睾丸损伤中, 随着生精细胞凋亡数目的增多, Fas和 FasL的表达量也相应提高并逐渐达到峰值。
Bcl一 2 家族成员引发的线粒体途径
在细胞凋亡中, 死亡信号通过 Bcl-2 家族或直接诱导线粒体膜通透性增加, 释放细胞素c ( Cyt c) , 激活半胱氨酸蛋白酶, 继而使细胞发生凋亡。
Bcl-2 家族的凋亡前体成员,一组BH3亚蛋白家族引发线粒体途径。胞外因素促使这些蛋白
与另一组Bcl-2家族的凋亡前体成员——Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated x protein,Bax)亚蛋白家族结合。Bax为可溶性蛋白,存在于生精细胞质,受诱导向细胞核移动,定位于核旁聚合的线粒体外膜,以诱导生精细胞凋亡。Olderid 等在凋亡生精细胞中检测剑 p53、p21、Bcl-2 和Bax的表达。Zhang等恒河猴隐睾症模型检测凋亡生精细胞,检测出Bax 转移剑细胞核附近及Bcl-2 表达增加,反映Bc1-2、Bax参与生精细胞凋亡。Bc1-2 和Bax的相互作用使Bax 聚合并横跨线粒体内外膜。
Bax的变化使原位于线粒体内膜caspases活化蛋白、Cyt—C从线粒体内移入胞质。释放的Cyt-C与胞质凋亡蛋白酶激活因子—1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)结合并诱导Apaf-1聚合,聚合Apaf-1 募集并活化procaspase-9。第二个caspases的线粒体激活因子(second mitochon—dria— derived activator of caspases,Smac) 同时从线粒体进入胞质, S ma c与APaf-1结合并促进procaspase一 9活化。Caspase一9募集并活procaspase-3,最终引发生精细胞凋亡。
Procaspase-3活化引发Bcl一2作用促死亡蛋白(Bc1-2-interacting death agonist,Bid)裂解,Bid为Bcl-2连接蛋白,可诱导Cyt— C从线粒体释放,从而与Bcl一2／Bax途径相联系。Yu等观察到大鼠凋亡生精细胞内存在Bc1-2／Bax及Fas／FasL,显示这2条途径有相关性 。
Bcl-2基因是线粒体途径的初始信号
Bcl- 2基因(B细胞淋巴瘤/白血病-2基因)是人B淋巴细胞的染体易位激活的原癌基因, 该基因编码一种细胞质膜蛋白, 能够抑制细胞的程序性死亡。
Bcl-2原癌基因存在于多种动物的许多正常组织内, 对凋亡具有抑制作用。它不能促进细胞增殖,但能延长细胞的生命期限。Bcl -2蛋白之间常常以同源二聚体形式存在。用免疫组化法检测正常人体睾丸内Bcl-2蛋白表达时发现,精子细胞呈现中度到高度染阳性(2+～4+) ,而精原细胞、初、次级精母细胞、支持细胞及间质细胞绝大多数染呈阴性。Bcl-2蛋白主要分布在生精细胞线粒体,可能通过阻止细胞内Ca2 +的流动,干扰过氧化物的产生和脂膜的过氧化而抑制细胞凋亡。Ba x则可能通过插入线粒体膜, 引起细胞素C (Cyt C )释放入细胞质而诱导生精细胞的凋亡。无细胞系统实验发现,外源性Bcl-2防止Cyt c释放与线粒体效用有关。在其他死亡信号不存在时, Bax 异位表达可以触发Cyt c的释放。Bax直接加入分离的线粒体环境中, 可以诱导Cyt c释放。但这种效应可被临近细胞Bcl-xl过表达或通过直接加入重组的Bcl-xl而阻断。但是, caspase抑制剂虽不影响Cyt c的释放, 但却可以有效地阻断caspase激活和延缓细胞凋亡。
通过研究基因敲除和转基因小鼠发现：Bcl- 2基因家族在精子发生中有重要作用, Bax过量表达可诱导细胞凋亡, Bcl- 2过量表达可抑制细胞凋亡, Bax敲除小鼠不能产生成熟精子, 曲细精管中有大量不正常精原细胞的累积, 最终导致不育；Bcl-2和Bcl-Xs表达水平高的小鼠精子发生不正常时同样可引起不育。还有人对鸡睾丸的发育过程进行了研究。结果发现,在鸡胚胎期的睾丸中几乎检测不到Bca- XL, 而在未成熟和成熟的睾丸中均可检测到。由于在成熟睾丸中处于减数分裂及减数分裂后的细胞占大多数, 因此说明Bcl-2和Bcl- XL在鸡精原细胞减数分裂及减数分裂后细胞凋亡过程中的调节作用有所不同。
细胞素C /Cyt— C是线粒体途径的关键节点
生精细胞DNA 受损引起p53表达,p53诱导Bax产生,引发Cyt C释放入胞质,进而发生caspases级联反应。在细胞凋亡中, 死亡信号通过Bcl-2家族或直接诱导线粒体膜通透性增加, 释放细胞素c (Cyt c) , 激活半胱氨酸蛋白酶, 继而使细胞发生凋亡。CytC是一个线粒体起源的细胞凋亡信号,Bcl-2可通过抑制CytC从线粒体的释放入细胞质, 而Bax、 Bak可与Bcl-2结合,阻止其CytC 释放孔道的抑制作用,从而促进 CytC 从线粒体释放,引起凋亡。CytC通过接头分子使caspase（胱冬肽酶）分子募集并相互酶解活化,进而诱导细胞凋亡。
Caspase-3 是线粒体途径的最终执行者
caspase-3 是介导细胞凋亡的关键效应酶,是凋亡执行的重要效应分子。正常情况下,caspase-3 以酶原的形式存在于细胞质中,无活性,当细胞接受凋亡刺激时,其被激活,而诱导凋亡。caspase-3 是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点,它的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志。
天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶(cysteinylaspartate- specific protease,Caspase)是执行细胞凋亡的蛋白酶家族,通过各种不同信号传导途径激活后降解或失活某些关键的细胞蛋白,并与凋亡的形态学特征密切相关。Caspase-3酶原能够被 caspase- 8、- 9、- 10以及颗粒酶B所激活,是细胞凋亡的主要执行者。有证据表明,细胞凋亡的某些特征性标志,如染体凝聚和DNA 片断化等均与caspase- 3 有直接关系。Caspase介导的细胞凋亡信号传导通路上,线粒体通路和死亡受体通路的交汇点也在caspase-3。Caspase-3对睾丸各级生精细胞凋亡的作用：潘连军等对睾丸静脉曲张大鼠各级生精细胞进行免疫组化检测,发现正常精原细胞及精母细胞胞质中均有少量caspase- 3表达,凋亡细胞则主要在细胞核表达,提示在睾丸静脉曲张所导致的生精细胞凋亡过程中发生了caspase-3由胞质向胞核的转位。用TUNEL
法检测凋亡生精细胞数目,试验组与对照组无明显差异,但试验组caspase- 3活性增加,提示caspase- 3 的激活可能与发生在凋亡早期阶段的生化改变有关。Kim等也发现了类似现象,但是目前其入核机制尚不清楚。生精细胞的凋亡是一个复杂的、多因素调控过程,因此,caspase－3活性的增加,不仅可以表明生精细胞凋亡的存在,而且还可以表明生精细胞凋亡的发生是caspase- 3 依赖性的,从而在一定程度上阐明了凋亡发生早期的分子机制。
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